3/1 : 20224

2.2.24. АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В ИНФРАКРАСНОЙ

ОБЛАСТИ

ОСНОВНОЙ ПРИНЦИП

Инфракрасная абсорбционная спектрофотометрия (также известная как инфракрасная (ИК)

спектроскопия) основана на взаимодействии инфракрасного излучения с веществом. В

результате взаимодействия между молекулой и инфракрасным излучением, поглощение

частот, характерное для данной молекулы, и некоторые межмолекулярные и

внутримолекулярные колебания могут быть возбуждены до более высоких колебательных

уровней. Полученный инфракрасный спектра поглощения с характерными полосами

соответствует функциональным группам молекулы.

Инфракрасная область длин волн может быть разделена на три подобласти: ближняя

инфракрасная, средняя инфракрасная и дальняя инфракрасная. Эти подобласти имеют

диапазоны длин волн, принятые общим соглашением и условно равные 0.82.5 мкм, 2.525

мкм и 25-1000 мкм соответственно. Однако, в ИК-спектроскопии волновое число

используют чаще, чем длину волны и рассчитывают его по формуле:

где:





– волновое число в обратных сантиметрах;

– длина волны в микрометрах.

Таким образом, 12 500  4000 см

- 1

 ближний инфракрасный, 4000400 см

- 1

 средний

инфракрасный и 40010 см

- 1

 дальний инфракрасный диапазоны.

В данной общей монографии рассматривают только спектроскопию в средней

инфракрасной области, т.е. 4000400 см

- 1

(2.525 мкм), которую здесь и далее для

простоты называют инфракрасной. В этой области основные молекулярные колебания

функциональных групп проявляются в спектре в виде полос поглощения. Область ниже

1500 см

-1

известна как «область отпечатков пальцев», очень сложная и информативная

часть спектра, которая характеризует исследуемую молекулу.

Средняя инфракрасная область граничит с ближней инфракрасной областью, имеющей

обертоны и комбинации основных колебаний, преимущественно C-H, N-H и O-H

функциональных групп (2.2.40) и дальней инфракрасной областью, в которой полосы

поглощения, связанны с модами кристаллической решетки, водородными связями,

угловыми деформационными колебаниями тяжелых атомов и молекулярными вращениями.

ПРИМЕНЕНИЕ

Так как полосы поглощения в ИК-спектрах характерны для основных функциональных

групп соединения, ИК-спектроскопию широко используют для идентификации веществ и

предоставления информации об их структуре. Она также может быть использована для

приложений количественных программ, устанавливающих математическую зависимость

между интенсивностью излучения поглощенного образцом и концентрацией исследуемого

компонента в испытуемом образце.

ИК-спектроскопию широко используют в фармацевтической области для химических и

физических лабораторных анализов, а также широко применяют в процессе производства

как описано ниже. Поэтому ИК-спектроскопию возможно применять в процессно–

аналитических технологиях (ПАТ/PAT) как часть передовой стратегии контроля.

Химический анализ:

 идентификация действующих (активных) веществ, вспомогательных веществ,

лекарственных форм, промежуточных продуктов, химических реактивов и

упаковочных материалов;

 оценка качества действующих (активных) веществ, вспомогательных веществ,

лекарственных форм, промежуточных продуктов и упаковочных материалов, включая

спектральное сравнение между партиями и оценку смены поставщика;

 количественное определение активных веществ в матрице образца, определение

содержания воды и растворителей;

 количественное определение примесей, например, в газах, неорганических

материалах;

 мониторинг реакций, например, в химическом синтезе.

Физический анализ:

 определение свойств твердого тела, таких как, полиморфизм.

ОГРАНИЧЕНИЯ

Существенные ограничения в использовании ИК-спектроскопии включают следующее:

 может потребоваться использование дополнительных методов для однозначной

идентификации вещества;

 невозможность различить чистые энантиомеры вещества;

 данный метод может оказаться непригодным для анализа следовых количеств;

 условия подготовки образца (например, давление, растворитель) могут изменить

кристаллическую форму вещества, которое проявляет полиморфизм;

 для гетерогенных образцов ограниченный объем пробы может быть проблематичным.

РЕЖИМЫ ИЗМЕРЕНИЯ

ИК-измерения основаны на прохождении излучения через или в образец и измерении

ослабления возникающего луча при различных длинах волн. Это соответствует двум

основным режимам измерения, т.е. пропусканию и ослаблению полного отражения. Кроме

этого существуют и другие режимы для конкретных приложений (например, диффузное и

зеркальное отражение).

РЕЖИМ ПРОПУСКАНИЯ

Данный режим основан на определении коэффициента пропускания (T), а именно

способности образца пропускать ИК-излучение при заданной длине волны (волновом

числе) и определяется следующим соотношением:

где:

– интенсивность падающего излучения;

– интенсивность проходящего излучения.

Полученный спектр представлен в виде коэффициента пропускания (T) по оси (y) в

сравнении с длиной волны или волновым числом по оси (x). Он также может быть

представлен в виде абсорбции (A) по оси y, которая связана с коэффициентом пропускания

(T) следующим уравнением:

где:

а – молярный коэффициент поглощения образца, в квадратных сантиметрах на моль

(см

моль

-1

);

b – толщина образца, в сантиметрах;

c – концентрация образца, в молях на кубический сантиметр(мольсм

-3

РЕЖИМ ПОЛНОГО ОТРАЖЕНИЯ

Режим полного отражения основан на явлении полного внутреннего отражения. Образец с

показателем преломления n

приводят в тесный контакт с кристаллом (алмазом, германием,

цинком, селенидом или любым другим подходящим материалом), имеющим показатель

преломления n

превышающий n

. Затем луч инфракрасного света пропускают через

кристалл. Когда угол α между падающим лучом и границей раздела образец – кристалл

превышает критическое значение α

, теоретически все излучение отражается (полное

внутреннее отражение). Тем не менее, возникает эванесцентная (затухающая) волна,

которая незначительно проникает в образец и поглощается часть энергии. Полное

отражение ослабевает, что позволяет получить спектр поглощения. На практике часто

используют многократные внутренние отражения для усиления интенсивности

поглощения, хотя некоторые приборы позволяют измерить поглощение при однократном

отражении. Глубина проникновения d

обычно составляет порядка нескольких микрометров

и определяется для длины волны λ следующим уравнением:

где:

– глубина проникновения;

λ – длина волны;

α – угол падения;

, n

– показатели преломления отражающего элемента и образца,

соответственно.

Вследствие взаимосвязи между этими параметрами интенсивность поглощения в режиме

полного отражения больше при более высоких длинах волн (т.е. меньших волновых чисел)

и происходит небольшое смещение полос при сравнении с соответствующим спектром

пропускания. Следовательно, нецелесообразно сравнивать спектры режима полного

отражения со спектрами пропускания при идентификации соединений.

ПРИБОРЫ

Наиболее часто используемыми ИК-спектрометрами являются ИК-спектрометры с Фурье-

преобразованием (ИК-Фурье), которые обычно состоят из:

 подходящего полихроматического источника света, например, проводящий керамический

стержень;

 интерферометра;

 приспособления для представления образца, например, держателя образца;

 детектора;

 соответствующего программного обеспечения для управления спектрометром и для

спектральной оценки и обработки данных.

Другие спектрометры, основанные на альтернативных принципах, также могут быть

использованы, если требования, описанные ниже в разделе Контроль работы прибора,

выполняются. ИК-спектрометры также могут использоваться совместно с микроскопом для

изучения небольшой части образца или для химической визуализации.

ИК-спектроскопия может быть связана с другими аналитическими методами такими, как

термический анализ или хроматография.

КОНТРОЛЬ РАБОТЫ ПРИБОРА

Такие параметры как точность шкалы волновых чисел и спектральное разрешение являются

критическими и должны быть проверены. Испытания, описанные ниже, могут быть

использованы для контроля характеристик прибора и для квалификации. Также они могут

быть использованы в качестве испытаний на пригодность системы.

Данные параметры проверяют с использованием подходящих стандартных образцов,

выбранных и представленных в зависимости от режима измерения (например, пропускание

или режим полного отражения).

Для количественного анализа также определяют соответствующие критерии оценки для

контроля интенсивности поглощения.

ШКАЛА ВОЛНОВЫХ ЧИСЕЛ

Шкалу волновых чисел обычно проверяют с использованием полистирольной пленки,

которая демонстрирует ИК-полосы поглощения при волновых числах, показанных в

таблице 2.2.24.-1.

Таблица 2.2.24.-.1 - Положение полос и соответствующие допустимые отклонения

полистирольной пленки, используемой для проверки точности волнового числа

Положение полосы (см

-1

)

Допустимые

отклонения

(см

-1

)

Трансмиссия (пропускание)

Режим полного

отражения

906.6

906.1

± 1.0

1028.3

1027.7

± 1.0

1601.2

1601.0

± 1.0

3060.0

3059.7

± 1.0

Для режимов измерения, отличных от пропускания или от режима полного отражения,

стандартные образцы должны быть определены пользователем.

СПЕКТРАЛЬНОЕ РАЗРЕШЕНИЕ

Рисунок 2.2.24.-1. - Типичный ИК-спектр поглощения

полистирола, используемого для проверки спектрального разрешения

Спектры, записанные в режиме пропускания. Спектральное разрешение обычно

проверяют с помощью полистирольной пленки толщиной примерно 35 мкм.

Критерии приемлемости (рис. 2.2.24.-1): разность между значениями поглощения в

минимуме поглощения при 2870 см

-1

(А) и максимуме поглощения при 2849.5 см

-1

(В)

должна быть более 0.33; разница между значениями поглощения в минимуме поглощения

при 1589 см

-1

(D) должна быть более 0.08.

Спектры, записанные в режиме полного отражения. Необходимо определять

соответствующие критерии для контроля спектрального разрешения в соответствии с

инструкциями каждого прибора. Для режимов измерения, отличных от пропускания или

режима полного пропускания, стандартные образцы должны быть определены

пользователем.

ПРОЦЕДУРА

ПОДГОТОВКА И ПРЕДСТАВЛЕНИЕ ОБРАЗЦА

Подготовка и представление пробы зависят от физического состояния испытуемого образца

и режима измерения. Режим пропускания применяют к прозрачным образцам, таким как,

чистые жидкости, растворы, газы или соответствующим образом подготовленные взвеси и

щелочно-галогенидные диски. Для жидкостей и газов используют ячейки с фиксированной

или переменной длиной пути и ИК-прозрачными окнами. Для щелочно-галогенидных

дисков используют специальные держатели образцов. Режим отражения, например, режим

полного отражения, подходит для измерения широкого спектра образцов в твердом и

жидком состоянии.

Некоторые режимы подготовки (например, для дисков и взвесей в режиме просвечивания

или для твердых частиц в режиме полного отражения) включают в себя шлифование и/или

приложение давления, что может вызвать неожиданные модификации кристаллов.

Режим пропускания

Испытуемый образец готовят одним из следующих способов в зависимости от состояния

образца (твердое, жидкое или газообразное). Образец полос в спектре должен иметь

минимальное пропускания не менее 5 %, если не казано иное.

Жидкости. Если испытуемый образец представляет жидкость, испытание проводят либо в

виде пленки между двумя пластинами, прозрачными для инфракрасного излучения, либо в

ячейке с подходящей длиной пути с прозрачными окнами для инфракрасного излучения.

Жидкости или твердые субстанции в растворе. Готовят раствор испытуемого образца в

подходящем растворителе. Выбирают концентрацию и длину пути, которые дают

удовлетворительный спектр. Как правило, хорошие результаты получают при

концентрации 10100 г/л для длины пути 0.50.1 мм. Поглощение растворителя

компенсируют путем последовательной регистрации спектров растворителя и раствора

испытуемого образца, вычитанием полос поглощения растворителя из спектра раствора

испытуемого образца.

Твердые частицы субстанции, диспергированные в твердом веществе (диск). Измельчают

испытуемый образец, принимая во внимание любые возможные изменения (например,

кристаллическая форма) и смешивают с подходящим количеством тонко измельченного и

высушенного порошка калия бромида Р или калия хлорида Р, если не указано иное.

Смесь нескольких миллиграммов (например, 12 мг) испытуемого образца, подлежащей

исследованию в нескольких сотнях миллиграммов (например, 300400 мг) галогенида

обычно достаточна для получения диска диаметром 1015 мм и спектра подходящей

интенсивности. Если испытуемый образец представляет собой соль гидрохлорида,

рекомендуется использовать калий хлорид Р. Тщательно измельчают смесь, равномерно

распределяя ее в подходящей матрице и прилагают соответствующее давление,

уплотняющая сила которого составляет около 800 Мпа и достаточна для приготовления

диска. Для испытуемых образцов, которые нестабильны при нормальных атмосферных

условиях или гигроскопичны, диск может быть спрессован под вакуумом. Некоторые

факторы могут привести к образованию дефектных дисков, например, недостаточное или

чрезмерное измельчение, влажность или примеси в дисперсионной среде. Например, любая

вода в образце или калии бромиде будет вызывать помутнение диска и приведет к низкому

пропусканию спектра. Диск бракуют, если визуальный осмотр показывает отсутствие

однородной прозрачности или когда в отсутствие определенной полосы поглощения,

пропускание составляет менее 60 %, или поглощение более 0.22 при около 2000 см

-1

мкм) без компенсации, если не указано иное.

Твердые частицы субстанции, диспергированные в жидкости (взвесь). Тритурация

небольшого количества испытуемого образца с минимальным количеством жидкого

парафина Р или другой подходящей жидкостью. Смесь из нескольких миллиграммов

(например, 510 мг) испытуемого образца в одной капле жидкого парафина Р обычно

достаточно для получения подходящей взвеси. Сжимают взвесь между двумя пластинами

прозрачными для инфракрасного излучения. Взвесь бракуют, если визуальный осмотр

показывает отсутствие однородной прозрачности или если спектр показывает такие

особенности, как:

 низкое пропускание при 4000 см

-1

;

 сильно наклоненная базовая линия между 4000 и около 2500 см

-1

;

 показатель относительных интенсивностей некоторых полос поглощения меньше

ожидаемого.

Расплавленные твердые вещества. Если указано в монографии, делают пленку из

расплавленной массы и фиксируют ее на подходящем держателе.

Выпаренный раствор. Если указано в монографии, испытуемый образец растворяют в

подходящем растворителе. Готовят пленку путем выпаривания растворителя на

подходящем носителе и фиксируют на подходящем держателе.

Газы. Используют подходящую ячейку, прозрачную для инфракрасного излучения.

Удаляют воздух из ячейки и заполняют ее до требуемого давления через запорный кран или

игольчатый клапан, используя подходящую линию передачи газа между ячейкой и

контейнером с исследуемым газом. При необходимости регулируют давление в ячейке до

атмосферного, используя газ, прозрачный для инфракрасного излучения (например, азот Р

или аргон Р), или продувают воздухом, не содержащим углерода диоксид. Необходимо

соблюдать соответствующий протокол измерений для компенсации воды, углерода

диоксида или других атмосферных газов.

Режим полного отражения

Режим полного отражения подходит для жидких и твердых образцов и не требует никакой

подготовки, кроме простой обработки, такой как измельчение крупных кристаллов и

грубого материала. Действуют следующим образом в зависимости от состояния образца

(жидкий или твердый).

Жидкости. Помещают испытуемый образец в контакт с кристаллом.

Твердые вещества. Обеспечивают тесный и равномерный контакт между испытуемым

образцом и всей поверхностью кристалла, либо с помощью давления, либо путем

растворения субстанции в соответствующем растворителе, затем покрывают кристалл

полученным раствором, выпаривая его досуха.

МЕТОДЫ

Инфракрасная спектроскопия в основном используется для идентификации веществ, но

также может применяться и для количественного анализа. Количественный анализ

(основанный на законе Бера-Ламберта, который связывает поглощение образца с его

концентрацией) не будет описан в этой монографии.

Измерение выполняют на соответствующим образом подготовленном образце. Затем

данные обрабатывают и оценивают, либо для идентификации веществ или их

количественного определения (например, на основе интеграции ИК-полос поглощения).

Спектральное качество может быть улучшено с помощью предварительной математической

обработки. На практике ограничиваются нормализацией спектра и вычитанием полос,

вызванных углерод диоксидом и водяным паром. Одинаковые предварительные обработки

выполняют как для спектра испытуемого, так и для стандартного образца.

Идентификация

Соответствующим образом готовят испытуемый образец и записывают спектры в

диапазоне от 4000 см

-1

до 650 см

-1

, если не указано иное.

Идентификационные испытания проводят путем сравнения спектра испытуемой

субстанции со спектром, полученным из стандартного образца или фармакопейным

стандартным спектром.

Спектр текущей партии фармакопейного стандартного образца может быть записан для

немедленного использования или сохранен, например, в спектральной библиотеке для

последующего использования. Сохраненный спектр может быть использован при условии,

что прослеживаемость к текущей партии фармакопейного стандартного образа

обеспечивается.

В случае веществ, которые не охвачены частными монографиями, может быть использован

подходящий стандартный образец.

Во всех случаях спектры должны быть записаны с использованием одних и тех же условий

работы и метода, и особенно в одном и том же режиме измерения.

Если сравнение спектров, записанных в твердом состоянии, показывает различия (см.

ниже), обрабатывают субстанцию и стандартный образец одинаковым способом так, чтобы

они перекристаллизовались и получались в одинаковой кристаллической форме или как

указано в частной монографии, а затем снова записывают спектры. Однако эта процедура

должна проводиться только в отношении субстанций, где в монографии не рассматривают

конкретную форму субстанции, проявляющую полиморфизм. Может быть использовано

несколько процедур сравнения, и аналитик должен задокументировать и обосновать

используемый метод и определенные критерии приемлемости, которые позволяют сделать

вывод об идентификации. Спектры можно сравнивать либо путем наложения спектров (во

всем спектральном диапазоне или в интересующей области, указанной в частной

монографии) или с помощью программного обеспечения. Например, можно выполнить:

 визуальное сравнение на основе положения полос и относительной интенсивности, если

не указано иное – минимумы пропускания (или максимумы поглощения) в спектре,

полученном с испытуемой субстанции, соответствуют по положению и относительной

величине с таковыми в стандартном образце;

 расчет коэффициента корреляции между двумя спектрами с помощью программного

обеспечения, а предел идентификации определяет пользователь;

 оценку хемометрическими методами (например, евклидово расстояние, расстояние

Махаланобиса, методы классификации); эти методы предполагают установку, оценку и

валидацию хемометрической модели аналитиком (см. 5.21. «Хемометрические методы,

применяемые к аналитическим данным»).

Примеси в газах

Для анализа примесей используют ячейку, прозрачную для инфракрасного излучения и

подходящей оптической длины пути (например, 120 м). Заполняют ячейку, как

предписано в разделе Газы. Для обнаружения и количественного определения примесей

действуют, как указано в частной монографии.