3/1:20227
2.2.27. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
ПРИНЦИП
Тонкослойная хроматография представляет собой метод разделения, в котором
используется неподвижная фаза, состоящая из подходящего материала, нанесенного в
виде тонкого слоя и зафиксированного на подложке (пластинке) из стекла, металла или
полимера. Перед хроматографированием растворы определяемых веществ наносят на
пластинку. Разделение основано на процессах адсорбции, распределения, ионного обмена
или на их комбинации и осуществляется посредством перемещения в тонком слое
(неподвижной фазе) определяемых веществ, растворенных в растворителе или в
соответствующей смеси растворителей (подвижной фазе).
ОБОРУДОВАНИЕ
Пластинки. Хроматографирование проводят с использованием пластинок, с полученных,
как указано в разделе 4.1.1. Реактивы.
Предварительная подготовка пластинок. При необходимости перед использованием
пластинки либо промывают путем хроматографирования в подходящем растворителе,
либо пропитывают посредством элюирования, погружения или опрыскивания, либо, при
необходимости, активируют, нагревая в сушильном шкафу при температуре 120 °С в
течение 20 мин.
Хроматографическая камера для вертикального элюирования представляет собой
резервуар с плотно подогнанной крышкой и с плоским дном или дном с двумя желобами
из инертного прозрачного материала, соответствующими по размеру используемым
пластинкам. Для горизонтального элюирования хроматографическая камера снабжена
желобом для подвижной фазы и дополнительно содержит устройство для подачи
подвижной фазы к неподвижной фазе.
Микропипетки, микрошприцы, калиброванные капилляры или другие устройства,
пригодные для надлежащего нанесения растворов.
Устройство для обнаружения флуоресценции используют для обнаружения (измерения)
непосредственной (непосредственно) флуоресценции или для ингибирования
флуоресценции.
Проявляющие устройства и реактивы. Для проявления разделенных веществ
используют подходящие устройства, пригодные для нанесения реактивов на пластинку
(посредством опрыскивания, погружения или обработки парами) и в случае
применимости нагревания.
Документация. Допускается использование устройств, обеспечивающих регистрацию
визуальных хроматограмм, например, фотографирование или создание компьютерного
файла.
МЕТОДИКА
Нанесение пробы. На линию, параллельную нижнему краю пластинки, на
соответствующем расстоянии от ее нижнего края и сторон наносят указанные объемы
растворов; расстояние между центрами круглых пятен должно составлять не менее 10 мм
(5 мм для пластинок для высокоэффективной тонкослойной хроматографии). Растворы
наносят минимальными порциями для получения пятен диаметром от 2 мм до 5 мм (от 1
мм до 2 мм для пластинок для пластинок для высокоэффективной тонкослойной
хроматографии) или полос длиной от 10 мм до 20 мм (от 5 мм до 10 мм для пластинок для
высокоэффективной тонкослойной хроматографии) и шириной от 1 мм до 2 мм.
Если в частной монографии предусмотрено использование наряду с обычными
пластинками и пластинок для высокоэффективной тонкослойной хроматографии, рабочие
условия для них указывают в квадратных скобках [] после указания условий для обычных
пластинок.
Вертикальное хроматографирование. Стенки хроматографической камеры выстилают
фильтровальной бумагой. Подвижную фазу наливают в камеру в количестве, достаточном
для того, чтобы после смачивания фильтровальной бумаги покрыть дно камеры слоем
жидкости, необходимым для хроматографирования. Для насыщения хроматографическую
камеру с подвижной фазой закрывают крышкой и выдерживают при температуре от 20 °С
до 25 °С в течение 1 ч. При отсутствии других указаний в частной монографии
хроматографирование проводят в насыщенной камере. Наносят указанные объемы
растворов как описано выше. После испарения растворителей из нанесенных проб
пластинку помещают в хроматографическую камеру как можно более вертикально, следя
за тем, чтобы пятна или полосы находились выше поверхности подвижной фазы. Камеру
закрывают, оставляют ее при температуре от 20 °С до 25 °С в защищенном от попадания
прямых солнечных лучей месте. После того, как подвижная фаза пройдет расстояние,
указанное в частной монографии, пластинку вынимают, сушат и обнаруживают пятна
способом, указанным в частной монографии.
В случае двухмерной хроматографии после первого хроматографирования пластинку
сушат и выполняют второе хроматографирование в направлении, перпендикулярном
первому.
Горизонтальное хроматографирование. Наносят указанные объемы растворов как
описано выше. После испарения растворителей из нанесенных проб в желоб
хроматографической камеры вводят с помощью шприца или пипетки достаточное
количество подвижной фазы, помещают пластинку, убеждаясь, что она расположена
горизонтально и подсоединена к устройству для подачи подвижной фазы в соответствии с
инструкцией производителя. Если указано в частной монографии, пластинку элюируют,
начиная одновременно с двух концов. Камеру закрывают и проводят
хроматографирование при температуре от 20 °С до 25 °С. После того, как подвижная фаза
пройдет расстояние, указанное в частной монографии, пластинку вынимают, сушат и
обнаруживают пятна указанным способом.
В случае двухмерной хроматографии после первого хроматографирования пластинку
сушат и выполняют второе хроматографирование в направлении, перпендикулярном
первому.
Параметры оценки пригодности системы описаны в общей монографии 2.2.46
Хроматографические методы разделения. Степень, до которой могут быть сделаны
корректировки хроматографических условий, также приведены в данной общей
монографии.
Предел, до которого могут быть сделаны корректировки хроматографических условий,
также приведены в данной общей монографии.
ВИЗУАЛЬНАЯ ОЦЕНКА
Идентификация. Визуально сравнивают цвет, размер и коэффициент замедления (R
F
)
основного пятна на хроматограмме испытуемого раствора с соответствующим пятном на
хроматограмме раствора сравнения.
Коэффициент замедления (R
F
) определяют как отношение расстояния от точки нанесения
пробы до центра пятна и расстояния, пройденного фронтом растворителя от точки
нанесения пробы.
Проверка разделяющей способности неподвижной фазы для идентификации. Обычно для
оценки пригодности достаточно испытания на пригодность неподвижной фазы,
описанного в общей монографии 4.1.1. Реактивы. В особых случаях для проверки
пригодности системы, могут быть указаны дополнительные критерии в частной
монографии.
Испытание на родственные примеси. Дополнительное(ые) пятно (пятна) на
хроматограмме испытуемого раствора, сравнивают визуально с соответствующим(и)
пятном (пятнами) на хроматограмме раствора сравнения. В качестве стандартного образца
для приготовления раствора сравнения используют как саму(и) примесь (примеси), так и
различные разведения испытуемого раствора.
Проверка разделяющей способности. Требования для проверки разделяющей способности
приводят в соответствующих частных монографиях.
Проверка чувствительности. Чувствительность считается удовлетворительной, если на
хроматограмме наиболее разведенного раствора сравнения четко обнаруживается пятно
или полоса.
КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ИЗМЕРЕНИЯ
Требования к разрешению и разделению приводят в соответствующих частных
монографиях.
В том случае, когда вещества, разделяемые методом тонкослойной хроматографии,
поглощают или флуоресцируют в ультрафиолетовом или видимом свете, их можно
количественно определить непосредственно на пластинке, используя подходящее
оборудование. Для этого измеряют отражение или пропускание падающего света,
передвигая пластинку или измеряющее устройство. Аналогичным образом, используя
подходящее оптическое оборудование, можно измерять флуоресценцию. Вещества,
содержащие радионуклиды, могут быть количественно определены тремя способами:
– непосредственно на пластинке — передвигая пластинки вдоль подходящего счетчика
радиоактивности либо наоборот (0125. Радиофармацевтические препараты);
– разрезанием пластинки на полосы и измерением радиоактивности на каждой отдельной
полосе, с использованием подходящего счетчика радиоактивности;
– соскребанием неподвижной фазы, растворением ее в подходящем сцинтилляционном
коктейле и измерением радиоактивности с использованием жидкостного
сцинтилляционного счетчика.
Оборудование. Оборудование для измерений непосредственно на пластинке включает в
себя:
– устройство для точного нанесения и воспроизводимого дозирования необходимого
количества веществ на пластинку;
– механическое устройство для передвижения пластинки или измерительного устройства
вдоль осей Х или Y (x или y);
– регистрирующее устройство и подходящий интегратор или компьютер;
– для веществ, поглощающих или флуоресцирующих в ультрафиолетовом или видимом
свете: для измерения коэффициента отражения или пропускания используются
фотометр с источником света, оптическое устройство, генерирующее
монохроматический свет, и фотоэлемент соответствующей чувствительности; в том
случае, когда измеряется флуоресценция, требуется подходящий монохроматический
фильтр для предотвращения попадания света, используемого для возбуждения на
детектор, в то же время, излучаемый свет или его определенную часть;
– для веществ, содержащих радионуклиды: подходящий счетчик радиоактивности; для него
необходимо проверить линейность диапазона.
Методика. Готовят испытуемый раствор, как указано в частной монографии и, при
необходимости, растворы сравнения, используя тот же растворитель, что и для
приготовления испытуемого раствора. На пластинку наносят одинаковые объемы каждого
из растворов и хроматографируют.
Вещества, поглощающие или флуоресцирующие в ультрафиолетовом или видимом свете.
Готовят и наносят не менее трех растворов сравнения, концентрации которых охватывают
предполагаемое значение концентрации испытуемого раствора (около 80 %, 100 % и 120
% от данной концентрации). Обрабатывают, при необходимости, указанным реактивом и
регистрируют коэффициент отражения, пропускания или флуоресценции на
хроматограммах испытуемого раствора и растворов сравнения. По полученным данным
рассчитывают количество вещества в испытуемом растворе.
Вещества, содержащие радионуклиды. Готовят и наносят испытуемый раствор,
содержащий около 100 % предполагаемого значения концентрации. Измеряют
радиоактивность как функцию длины пути и записывают радиоактивность каждого
полученного пика в процентах от суммарной радиоактивности.
