3/1:20229

2.2.29. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

ПРИНЦИП

Жидкостная хроматография представляет собой метод хроматографического разделения,

основанный на различном распределении веществ между двумя не смешивающимися

фазами, в котором подвижная фаза проходит через неподвижную фазу, находящуюся в

колонке.

Жидкостная хроматография основана на механизмах адсорбции, распределения по массам,

ионного обмена, эксклюзионного или стереохимического взаимодействия.

При отсутствии других указаний, настоящая монография распространяется на стандартную

жидкостную хроматографию. Также распространяется на жидкостную хроматографию с

использованием колонки с уменьшенным размером частиц (например, менее 2.0 мкм), где

требуется оборудование, способное выдерживать более высокое давление (обычно до 100

МПа, т.е., около 15 000 psi), генерирующее меньшее расширение полосы вне колонки,

обеспечивающих улучшенные градиентные смешивания и позволяющих увеличить частоту

отбора проб в системе обнаружения.

ПРИБОР

Прибор состоит из:

– насосной системы;

– блока ввода пробы (инжектора);

– хроматографической колонки (может использоваться устройство контроля температуры

колонки);

– одного или более детекторов;

– системы сбора данных.

Подвижная фаза из одной или нескольких емкостей протекает через блок для ввода пробы,

колонку, а затем через детектор(ы) с постоянной скоростью.

НАСОСНАЯ СИСТЕМА

В жидкостной хроматографии насосная система необходима для доставки подвижной

фазы с контролируемой скоростью потока. Колебания давления должны быть

миниминизированы, например, путем пропускания подвижной фазы под давлением через

демпферное устройство. Система труб и соединений должны выдерживать давление,

развиваемое насосной системой. Насосные системы, использующиеся в ЖХ, могут быть

оснащены дегазаторами.

Насосные системы, контролируемые микропроцессором, должны обеспечивать точную

подачу подвижной фазы постоянного (изократическое элюирование) или переменного

(градиентное элюирование) состава в соответствии с заданной программой. В случае

градиентного элюирования насосные системы доставляют из нескольких резервуаров

растворители, смешивание которых происходит при низком либо высоком давлении,

создаваемом насосами.

БЛОК ВВОДА ПРОБ (ИНЖЕКТОР)

Пробу испытуемого раствора вводят в поток подвижной фазы, поступающей в колонку, при

помощи блока ввода проб, функционирующего при высоком давлении. Для ввода пробы

используют петлевые дозаторы фиксированного объема или устройства с регулируемым

объемом, которые могут управляться вручную или автоматически. Частичное заполнение

петлевого дозатора вручную снижает точность вводимого объема пробы.

НЕПОДВИЖНЫЕ ФАЗЫ

В жидкостной хроматографии используют неподвижные фазы следующих типов:

– силикагель или алюминия оксид, используемый в нормально-фазовой хроматографии

(полярная неподвижная фаза и неполярная подвижная фаза), в которой разделение

основано на разнице адсорбции на неподвижной фазе и/или массовом распределении

между подвижной и неподвижной фазами (распределительная хроматография);

– различные химически модифицированные носители, изготовленные из полимеров,

силикагеля или пористого графита, используемые в нормально-фазовой и обращенно-

фазовой (неполярная неподвижная фаза и полярная подвижная фаза), в которой

разделение основано на разделении молекул между подвижной и неподвижной фазами;

– смолы или полимеры модифицированные кислотными или основными группами,

используемые в ионообменной хроматографии, в которой разделение основано на

конкурирующем взаимодействии между разделяемыми ионами и ионами подвижной

фазы;

– пористый силикагель или полимеры, используемые в эксклюзионной хроматографии

(2.2.30), в которой разделение основано на разнице в размерах молекул,

соответствующих стерической эксклюзии;

– специальные химически модифицированные неподвижные фазы, например, производные

целлюлозы или амилозы, белками или пептидами, циклодекстринами и т. д.,

используемые для разделения энантиомеров (хроматография на хиральных

неподвижных фазах).

В большинстве случаев механизм разделения в обращенно-фазовой хроматографии основан

на использовании в качестве неподвижной фазы химически модифицированного

силикагеля. Поверхность носителя, например, силанольные группы силикагеля, реагирует с

различными силановыми реагентами с образованием ковалентно связанных силильных

производных, покрывающих различное число активных групп на поверхности носителя.

Природа привитой фазы является важным параметром, определяющим разделяющие

свойства хроматографической системы.

При отсутствии других указаний производителя, находящаяся в колонках обращенно-

фазовая неподвижная фаза на основе силикагеля считается стабильной в подвижных фазах,

при значениях рН в диапазоне от 2.0 до 8.0. Колонки, содержащие пористый графит или

частицы полимерных материалов, например, сополимер стирола с дивинилбензолом,

стабильны в более широком диапазоне значений рН.

В некоторых случаях для испытания применяют нормально-фазовую хроматографию,

используя в качестве неподвижной фазы немодифицированный силикагель или силикагель,

химически модифицированный полярными группами (например, цианопропилными или

диольными).

Для аналитического разделения размер частиц большинства используемых неподвижных

фаз составляет от 2 до 10 мкм. Частицы могут иметь сферическую или неправильную

форму, различную пористость и удельную площадь поверхности. Данные параметры

определяют хроматографическое поведение конкретных неподвижных фаз. В обращенно-

фазовой хроматографии, дополнительными определяющими факторами являются природа

неподвижной фазы, степень связывания, выраженная содержанием углерода, и

эндкепирование (т.е. силилирование оставшихся силанольных групп). Наличие остаточных

силанольных групп может являться причиной размывания заднего фронта пиков, особенно

у основных веществ. Кроме пористых частиц могут быть использованы поверхностно-

пористые или монолитные материалы.

При отсутствии других указаний в частной монографии для аналитической хроматографии

используют колонки из нержавеющей стали различной длины и внутреннего диаметра (Ø).

Колонки с внутренним диаметром менее 2 мм часто относят к микроколонкам. Температура

подвижной фазы и колонки в течение испытания должна быть постоянной. Для

обеспечения оптимального функционирования колонки может потребоваться

использование других температур в соответствии с частной монографией, но большинство

испытаний проводятся при температуре от 20 С до 25 С.

ПОДВИЖНЫЕ ФАЗЫ

Для нормально-фазовой жидкостной хроматографии обычно используют малополярные

органические растворители. Для получения воспроизводимых результатов нормально-

фазовой хроматографии необходимо строго контролировать содержание воды в

растворителях, используемых в подвижной фазе.

В обращенно-фазовой жидкостной хроматографии используют водные подвижные фазы с

органическими растворителями и/или модификаторами.

Компоненты подвижной фазы обычно фильтруют для удаления частиц размером более 0.45

мкм (или более 0.2 мкм, если неподвижная фаза состоит из частиц размером менее 2.0 мкм,

а также, если используются специальные детекторы, например, детекторы светорассеяния).

При приготовлении многокомпонентных подвижных фаз смешивают отмеренные объемы

(если массы не указаны) необходимых индивидуальных компонентов. Кроме этого,

растворители могут подаваться индивидуальными насосами, снабженными дозирующими

клапанами, с помощью которых осуществляют смешивание растворителей в необходимых

пропорциях. Во избежание образования пузырьков газа в ячейке детектора растворители

обычно дегазируют перед прокачкой путем пропускания через них гелия, обработкой

ультразвуком и/или использованием встроенных мембранных/вакуумных модулей,

работающих в системе «on line».

Растворители для приготовления подвижной фазы обычно не содержат стабилизаторов, а

при использовании ультрафиолетового детектора должны быть прозрачными при длине

волны детектирования. Растворители и другие используемые компоненты должны быть

надлежащего качества. Например, воду для хроматографии Р используют для

приготовления подвижных фаз, когда один из компонентов является вода или водный

раствор. При необходимости значение рН корректируют, используя только водный

компонент подвижной фазы, но не смеси. При использовании буферных растворов или

солевых растворов для предотвращения кристаллизации солей по окончании

хроматографирования систему промывают смесью воды и небольшого количества

органической части подвижной фазы (5 % об/об).

Подвижные фазы могут содержать другие компоненты, например, контр-ион для ионно-

парной хроматографии или хиральный селектор для хроматографии, использующей

ахиральную неподвижную фазу.

ДЕТЕКТОРЫ

Наиболее часто в качестве детекторов используют спектрофотометры, работающие в

ультрафиолетовой/видимой областях, включая детекторы с диодной матрицей (2.2.25).

Кроме того, могут использоваться флуоресцентные спектрофотометры, дифференциальные

рефрактометры, электрохимические детекторы, светорассеивающие детекторы, детекторы

заряженных аэрозолей, масс-спектрометры (2.2.43), детекторы радиоактивности, детекторы

многоуглового светорассеяния и другие детекторы.

МЕТОДИКА

Колонку уравновешивают указанной подвижной фазой и скоростью потока при

температуре от 20 °C до 25 °C или температуре, указанной в частной монографии, до

получения стабильной базовой линии. Готовят испытуемый(е) раствор(ы) и раствор(ы)

сравнения. Растворы не должны содержать твердых частиц.

Критерии оценки пригодности хроматографической системы описаны в общей монографии

2.2.46. Хроматографические методы разделения. В данной общей монографии также

приведены пределы, в которых могут корректироваться параметры хроматографической

системы для соответствия критериям ее пригодности.