3/1:20230

2.2.30. ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

ПРИНЦИП

Эксклюзионная хроматография представляет собой хроматографический метод

разделения молекул в растворе в соответствии с их размерами (2.2.29). При использовании

органической подвижной фазы метод называют гель-проникающей хроматографией, а при

использовании водной подвижной фазы — гель-фильтрационной хроматографией. Проба

вводится в колонку, заполненную гелем или пористыми частицами наполнителя, и

переносится подвижной фазой через колонку. Разделение по размерам происходит за счет

неоднократного обмена молекул растворенного вещества между молекулами растворителя

подвижной фазы и тем же растворителем, находящимся в порах материала, которым

заполнена колонка (неподвижная фаза). Диапазон размеров разделяемых молекул

определяется диапазоном размеров пор наполнителя.

Достаточно маленькие молекулы проникают во все поры материала наполнителя и

элюируются в полном проникающем объеме колонки (V

). Молекулы с размерами,

превышающими размер всех пор материала колонки, мигрируют лишь через пространство

между частицами наполнителя, не удерживаясь им и элюируются в свободном объеме

колонки или объеме эксклюзии (V

объем пустот). Разделение молекул в соответствии с

размерами происходит объемом эксклюзии и полным проникающим объемом колонки;

наиболее эффективное разделение происходит в первые две трети данного диапазона.

ПРИБОР

Основной частью прибора является хроматографическая колонка с различными длиной и

внутренним диаметром, заполненная материалом, обеспечивающим разделение молекул по

размерам в необходимом диапазоне. При необходимости колонку термостатируют. В

качестве наполнителя может использоваться или мягкий носитель, например, набухший

гель, или твердый, например, пористое стекло, силикагель или подходящий для данного

растворителя поперечно-сшитый органический полимер. При использовании твердых

носителей обычно требуется подача подвижной фазы под давлением, что ускоряет

разделение.

К одному концу колонки обычно присоединяют устройство (блок) для ввода пробы,

например, адаптер потока, шприц с мембраной или клапаном впрыска (инжекторный

клапан), а также может быть присоединен соответствующий насос для подачи элюента с

контролируемой скоростью. Проба может также наноситься непосредственно на сухую

поверхность материала колонки или, если плотность пробы превышает плотность элюента,

может наслаиваться на поверхность материала колонки под элюент.

Подвижную фазу выбирают в соответствии с типом образца, средой разделения и методом

детектирования. Элюент пропускают через колонку с постоянной скоростью. Другой конец

колонки обычно присоединяют к соответствующему детектору с автоматическим

регистрирующим устройством, обеспечивающим контроль относительных концентраций

разделенных компонентов пробы.

В основном используются детекторы с фотометрическими, рефрактометрическими и

люминисцентными свойствами (ультрафиолетовые/видимые спектрофотометры (2.2.25),

дифференциальные рефрактометры, люминесцентные детекторы) и детекторы

многоуглового светорассеяния. Могут быть использованы и другие детекторы. При

необходимости может быть присоединен автоматический коллектор фракций.

МЕТОДИКА

Перед проведением разделения неподвижную фазу обрабатывают и заполняют колонку в

соответствии с указаниями в частной монографии, или инструкцией производителя.

Критерии оценки пригодности хроматографической системы описаны в общей монографии

2.2.46. Хроматографические методы разделения. С целью соблюдения критериев проверки

пригодности хроматографической системы в данном разделе также приведены допустимые

пределы корректирования параметров хроматографической системы.

В данной общей монографии также приведены пределы, в которых могут корректироваться

параметры хроматографической системы для соответствия критериям ее пригодности.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОГО КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА СМЕСЕЙ

Разделение проводят в соответствии с указаниями в частной монографии. По возможности

постоянно контролируют элюирование компонентов и измеряют площади

соответствующих пиков. Если контроль пробы испытуемого образца проводится по

физико-химическому свойству, по которому все рассматриваемые компоненты дают

одинаковые аналитические сигналы (например, одинаковое удельное оптическое

поглощение), относительное содержание каждого компонента рассчитывают как

отношение площади пика соответствующего компонента к сумме площадей пиков всех

компонентов. Если, аналитические сигналы компонентов по детектируемому свойству

отличаются, содержание каждого компонента рассчитывают по калибровочным графикам,

полученным с использованием соответствующих стандартных образцов в соответствии с

указаниями в частной монографии.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС

Эксклюзионная хроматография может быть использована для определения молекулярных

масс путем сравнения с соответствующими стандартными образцами для калибровки,

указанными в частной монографии.

Для стандартных образцов строят график зависимости объема удерживания веществ от

логарифма их молекулярных масс. График, построенный в пределах, ограниченных

значениями объема эксклюзии и полного проникающего объема, обычно приближается к

прямой линии для данной колонки в данных экспериментальных условиях. По данному

графику могут быть рассчитаны значения молекулярных масс. Использование метода

калибровочного графика для молекулярно-массового распределения позволяет получать

достоверные результаты лишь для частных случаев систем высокомолекулярное

вещество/растворитель в описанных экспериментальных условиях.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИМЕРОВ ПО РАЗМЕРАМ

Эксклюзионная хроматография может быть использована для определения молекулярно-

массового распределения размеров молекул полимеров. Однако сравнивать между собой

можно лишь результаты, полученные в одинаковых экспериментальных условиях.

Стандартные образцы, используемые для калибровки, и методики определения

молекулярно-массового распределения молекул полимеров описывают в частных

монографиях.