3 /1 :20231
2.2.31. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
ОБЩИЙ ПРИНЦИП
Под воздействием электрического поля заряженные частицы, растворенные или
диспергированные в растворе электролита, мигрируют в направлении электрода, имеющего
противоположную полярность.
В гель-электрофорезе движение частиц замедляется за счет взаимодействия с окружающей
гелевой матрицей, действующей как молекулярное сито.
Противоположные взаимодействия электрических сил и молекулярной фильтрации
приводят к разной скорости миграции в зависимости от размеров, формы и заряда частиц.
При электрофорезе вследствие различий физико-химических свойств разные
макромолекулы в смеси мигрируют с разной скоростью и, таким образом, делясь на
дискретные фракции. Электрофоретическое разделение можно проводить в системах без
неподвижных фаз (например, свободное разделение свободного раствора в капиллярном
электрофорезе) и в стабилизированных средах, таких как тонкослойные пластины, пленки
или гели.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ СО СВОБОДНОЙ ИЛИ ПОДВИЖНОЙ ГРАНИЦЕЙ
Этот метод в основном используют для определения подвижности, являющейся
экспериментальной характеристикой веществ, непосредственно измеряемой и
воспроизводимой. Он применяется в основном для веществ с высокой относительной
молекулярной массой, обладающих слабой диффузией. Границы первоначально
определяют физическими методами, например, рефрактометрией или кондуктометрией.
После наложения определенного электрического поля, в течение точно измеренного
времени, определяют новые границы и их относительное положение. Условия испытания
подбирают так, чтобы можно было определять столько границ, сколько компонентов
присутствует в испытуемом образце.
ЗОНАЛЬНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФАЗЫ НОСИТЕЛЯ
Данный метод требует использования только небольших образцов. Природа носителя,
например, бумага, агаровый гель, целлюлозы ацетат, крахмал, агароза, метакриламид,
смешанный гель, создает ряд дополнительных факторов, изменяющих подвижность:
a) в результате капиллярных эффектов в фазе носителя кажущееся пройденное
расстояние меньше реального;
b) некоторые фазы носителя не являются электрически нейтральными. Поскольку
среда представляет собой неподвижную фазу, она может иногда вызывать
значительный электроэндосмотический поток;
с) любое нагревание за счет эффекта Джоуля может вызвать некоторое испарение
жидкости с фазы носителя, что, в силу капиллярного эффекта, вызывает движение
раствора от краев к центру. Поэтому ионная сила имеет тенденцию постепенно
увеличиваться.
Скорость миграции зависит от четырех основных факторов:
– подвижности заряженной частицы, электроэндосмотического воздействия, потока
испарения и напряженности поля. Поэтому, необходимо работать в строго определенных
экспериментальных условиях и использовать, по возможности, стандартные вещества.
Прибор для электрофореза состоит из:
генератора постоянного тока, напряжение которого можно контролировать и,
желательно, стабилизировать;
электрофоретической камеры.
Обычно она имеет прямоугольную форму и сделана из стекла или жесткого пластика, с
двумя отдельными отсеками, анодным и катодным, содержащими раствор электролита. В
каждый отсек погружают электрод, например, из платины или графита. Их подключают с
помощью изолированной цепи к соответствующей клемме источника питания, образуя
анод и катод. Уровень жидкости в двух отсеках должен быть одинаковым, чтобы
предотвратить сифонирование. Камера для электрофореза оснащена герметичной крышкой,
которая поддерживает атмосферу насыщенную влагой во время испытания и уменьшает
испарение растворителя. При снятии крышки используют защитное устройство для
отключения питания. Если электрическая мощность, измеряемая по полосе превышает 10
Вт, желательно охладить носитель.
приспособление для установки носителя:
Электрофорез на полоске. Несущую полоску, предварительно смачивают тем же
проводящим раствором и погружают каждый конец в электродный отсек,
соответствующим образом затягивая и фиксируя на подходящем держателе,
предназначенном для предотвращения диффузии электролита, например, на
горизонтальной раме, перевернутой V-образной подставке или однородной поверхности с
контактными точками, расположенными через определенные интервалы.
Гель-электрофорез. Приспособление состоит в основном из стеклянной пластины
(например, предметного стекла микроскопа), на всю поверхность которой нанесен прочно
закрепленный слой геля одинаковой толщины. Соединение между гелем и проводящим
раствором осуществляется разными способами в зависимости от типа используемого
прибора. Необходимо принимать меры предосторожности, чтобы избежать конденсации
влаги или высыхания твѐрдого слоя.
– измерительное устройство или детектор
Методика. Раствор электролита помещают в электродные отсеки. Носитель, пропитанный
раствором электролита, помещают в камеру в соответствии с инструкцией для
используемого типа прибора. Устанавливают линию старта и наносят образец. Подают
электрический ток в течение указанного времени. После отключения тока, извлекают
носитель из камеры, высушивают и визуализируют.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА КОЛОНКАХ С ПОЛИАКРИЛАМИДНЫМ ГЕЛЕМ
При электрофорезе на колонках с полиакриламидным гелем стационарной фазой является
гель, приготовленный из смеси акриламида и N,N′-метиленбисакриламида. Гель готовят в
трубках длиной 7.5 см и внутренним диаметром 0.5 см, во всех трубках должен быть
использован один и тот же раствор.
Прибор. Прибор для буферного раствора состоит из двух вертикально установленных один
над другим резервуаров, изготовленных из подходящего материала, такого как
поли(метилметакрилат). Каждый резервуар оснащен платиновым электродом. Электроды
присоединены к источнику питания, позволяющему работать либо при постоянном токе,
либо при постоянном напряжении. Прибор имеет в основании верхнего резервуара ряд
держателей, равноудаленных от электродов.
Методика. Обычно растворы дегазируют перед полимеризацией, а гели используют сразу
после приготовления. Готовят смесь компонентов согласно инструкции и разливают в
подходящие закупоренные снизу стеклянные трубки, на одинаковую высоту и примерно на
1 см от верхнего края, следя за тем, чтобы в трубках отсутствовали пузырьки воздуха. На
смесь геля наслаивают слой воды Р, чтобы исключить доступ воздуха и дают ей застыть.
Формирование геля обычно занимает около 30 мин и завершается, когда появляется четкая
граница раздела между гелем и слоем воды. Водный слой удалят. Нижний резервуар
наполняют указанным буферным раствором. Трубки открывают и вставляют в держатели
верхнего резервуара так, чтобы дно трубок было погружено в буферный раствор нижнего
резервуара. Трубки осторожно наполняют указанным буферным раствором. Готовят
испытуемые растворы и растворы сравнения, содержащие индикаторный краситель, и
уплотняют путем растворения в них, например, сахарозы Р. Приготовленные образцы
наслаивают на поверхность геля, используя для каждого образца отдельную колонку.
Верхний резервуар наполняют тем же буферным раствором. Электроды подключают к
источнику тока и проводят процесс электрофореза при указанных условиях: температуре и
постоянном напряжении или токе. Источник тока отключают, когда индикаторный
краситель почти переходит в нижний резервуар. Каждую трубку сразу вынимают из
прибора и извлекают гель. Определяют местоположение полос на электрофореграмме.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ, СОДЕРЖАЩЕМ НАТРИЯ
ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТ (НДС-ПААГ)
(НДС-ПААГ )– ГЕЛИ С ОДНОРОДНОЙ КОНЦЕНТРАЦИЕЙ
Область применения. Электрофорез в полиакриламидном геле применяется для
качественной идентификации белков в биологических лекарственных средствах, контроля
их чистоты и количественных определений.
Цель. Аналитический гель-электрофорез — метод, позволяющий идентифицировать и
оценить гомогенность белков в лекарственных средствах. Метод обычно используют для
определения молекулярных масс белковых субъединиц и субъединичного состава
очищенных белков.
Имеется разнообразный ассортимент коммерчески доступных готовых к использованию
гелей и реактивов, которые могут быть использованы вместо описанных в данном разделе,
если получаются эквивалентные результаты и выполняются условия раздела «Валидация
испытания», приведенного ниже.
Свойства полиакриамидных гелей
Ситовые свойства полиакриламидных гелей обусловлены трехмерной сеткой волокон или
пор, образующихся при сшивании бифункциональным бисакриламидом соседних
полиакриламидных цепей. Процесс полимеризации катализирует система генерирующая
свободные радикалы, состоящая из аммония персульфата и N,N,N',N'-
тетраметилэтилендиамина.
При увеличении концентрации акриламида в геле уменьшается эффективный размер пор.
Эффективный размер пор геля функционально определяется его просеивающими
свойствами, то есть сопротивлением, которое он придает миграции макромолекул. Из этого
следует, что акриламид может использоваться только в определенных концентрациях. При
высоких концентрациях акриламида гели чаще ломаются и являются сложными в
обработке. При уменьшении размера пор геля, уменьшается скорость миграции белка через
гель. Регулируя размер пор и концентрацию акриламида, можно оптимизировать
разрешающую способность метода для конкретного анализируемого белка.
Следовательно, конкретный гель характеризуется соответствующим содержанием
акриламида и бисакриламида.
Кроме состава геля, важным компонентом электрофоретической подвижности является
состояние белка. В случае определения белков электрофоретическая подвижность зависит
от значения pK заряженных групп и размера молекулы. На это влияют тип, концентрация и
рН буфера, температура и сила электрического поля, а также природа материала носителя.
Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле
Данный метод является примером анализа мономерных полипептидов с молекулярной
массой от 14 000 дальтон до 100 000 дальтон. Возможно расширение границ молекулярных
масс с использованием различных способов (например, путем использования градиентных
гелей, особенностей буферной системы). Например, трицин-ПААГ гели, содержащие
трицин в качестве отстающего иона в разделяющем буферном растворе для электрофореза
(вместо глицина, как в методике, описанной ниже), позволяют разделять очень маленькие
белки и пептиды от 10 000 до15 000 дальтон.
Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле с использованием
глициннатрия додецилсульфата наиболее общепринятый метод электрофореза, который
используют для оценки качества белков в фармацевтической продукции и описан ниже в
качестве примера указанного метода. Обычно аналитический электрофорез белков
проводят в полиакриламидных гелях в условиях, обеспечивающих диссоциацию белков на
отдельные полипептидные субъединицы и минимизирующих их агрегацию. Чаще всего,
перед нанесением на гель белки подвергают диссоциации, нагревая их с сильным
анионным детергентом натрия додецилсулфатом. Денатурированные полипептиды
связываются с натрия додецилсулфатом, превращаясь в отрицательно заряженные частички
с постоянным отношением массы к заряду независимо от типа белка. Поскольку
количество связанного натрия додецилсулфатом почти всегда пропорционально
молекулярной массе полипептида и не зависит от его последовательности, натрия
додецилсулфат-полипептидные комплексы мигрируют в полиакриламидном геле со
скоростью, зависящей от размера полипептида.
Электрофоретическая подвижность полученных детергент-полипептидных комплексов
находится в функциональной взаимосвязи с их молекулярными массами. Миграция натрия
додецилсулфат-комплексов происходит в направлении к аноду предсказуемым образом:
комплексы с низкими молекулярными массами движутся быстрее, чем с большими
молекулярными массами. Следовательно, молекулярная масса белка может быть
определена калибровкой натрия додецилсулфат-ПААГ, и наличие единичной полосы в геле
является критерием чистоты белка.
Однако модификации полипептидной цепи, например, N- или О-гликозидными, приводят к
значительному влиянию на кажущуюся среднюю молекулярную массу белка, так как
натрия додецилсулфат не связывается с углеводным компонентом так, как с
полипептидным. В этом случае постоянное отношение заряда к молекулярной массе не
сохраняется. В зависимости от степени гликозилирования и других посттрансляционных
модификаций, кажущаяся молекулярная масса белков, не является истинным отображением
массы полипептидной цепи.
Восстанавливающие условия. Полипептидные субъединицы и трехмерная структура
белков часто поддерживаются благодаря присутствию дисульфидных связей. Целью натрия
додецилсулфат-ПААГ испытаний в восстановленных условиях является разрушение
структуры белка восстановлением дисульфидных связей. Полная денатурация и
диссоциация белков обработкой 2-меркаптоэтанолом или дитиотреитолом приводит к
развертыванию полипептидной цепи и дальнейшему комплексообразованию с натрия
додецилсулфатом. В этих условиях молекулярную массу полипептидных субъединиц
можно рассчитать путем линейной регрессии (или более точно, нелинейной регрессии) с
помощью соответствующих стандартов молекулярных масс.
Невосстанавливающие условия. Для ряда испытаний полная диссоциация белка на
субъединичные пептиды невозможна. Из-за отсутствия восстанавливающих агентов, таких,
как 2-меркаптоэтанол или дитиотреитол, дисульфидные ковалентные связи становятся
недоступными, сохраняя олигомерную форму белка. Олигомерные натрия додецилсулфат-
белковые комплексы мигрируют медленнее, чем их натрия додецилсулфат-полипептидные
субъединицы. Кроме того, невосстановленные белки не могут быть целиком насыщены
натрия додецилсулфатом и, соответственно, не могут связывать детергент с постоянным
соотношением масс в постоянном массовом соотношении. Кроме того, дисульфидные связи
внутри цепи ограничивают молекулярную форму, таким образом, чтобы уменьшить радиус
Стокса (гидродинамического радиуса) молекулы, тем самым уменьшая кажущуюся
молекулярную массу M
r
. Это делает молекулярно-массовое определение молекулярной
массы этих молекул с помощью натрия додецилсулфат-ПААГ неадекватным в сравнении с
анализом полностью денатурированных полипептидов, так как необходимо наличие
стандартов, которые имеют идентичную с неизвестным испытуемым белком конфигурацию
для адекватного сравнения.
Характеристики электрофореза в геле с прерывистой буферной системой (диск-
электрофорез)
Наиболее широко используемый электрофоретический метод исследования для сложных
белковых смесей включает прерывистую буферную систему, состоящую из двух смежных
гелей: разрешающего или разделяющего (нижнего) геля и концентрирующего (верхнего)
геля. Эти два геля различаются пористостью, pH и ионной силой. Кроме того, в геле
используются различные по подвижности ионы и электродные буферы. Благодаря
буферной прерывистости происходит концентрация больших объемов образца в
концентрирующем геле, приводя к улучшению разрешения. После подключения источника
тока перепад напряжения приводит к тому, что белки проникают в концентрирующий гель.
Глицинат-ионы из электродного буфера двигаются вслед за белками в концентрирующий
гель и быстро образуют область подвижной границы с высокоподвижными хлорид-ионами
на переднем краю и относительно медленными глицинат-ионами на заднем краю.
Образуется локализованный высоковольтный градиент между фронтами лидирующих и
отстающих ионов, заставляя натрия додецилсулфат-белковые комплексы формировать
тонкие зоны (полосы) и мигрировать между фазами хлорида и глицината. В широких
границах, независимо от высоты нанесенного образца, все натрия додецилсулфат-белки
концентрируются в очень узкую область и двигаются к разделяющему гелю в виде четко
определенной тонкой зоны с высокой плотностью белка. Крупнопористый
концентрирующий гель не задерживает миграцию большинства белков и, в основном,
служит антиконвективной средой. На границе раздела концентрирующего и разделяющего
гелей происходит резкое возрастание эффекта задерживания белков вследствие
ограниченного размера пор разделяющего геля. Одновременно движение белков в
разделяющем геле продолжает замедляться вследствие ситовых свойств матрицы.
Глицинат-ионы догоняют белки, которые далее передвигаются в пространстве с
постоянным рН, образованным трис(гидроксиметил)аминометаном и глицином.
Молекулярно-ситовые свойства фазы приводят к разделу натрия додецилсулфат-
полипептидных комплексов в соответствии с их молекулярными массами.
Приготовление вертикальных прерывисто-буферных натрия додецилсулфат
полиакриламидных гелей
В данном разделе описано приготовление гелей с использованием специального
оборудования. Это не относится к предварительно приготовленным гелям. Для готовых
гелей или любого другого коммерчески доступного оборудования, следует
руководствоваться инструкциями производителя.
Рекомендуется использовать коммерчески доступные реактивы, очищенные в растворе. В
случае, если чистота используемых реактивов не достаточна, применяют предварительную
обработку. Например, любой раствор, недостаточно чистый для фильтрации, должен быть
также деионизирован с помощью смешанного слоя (анион/катионообменной) смолы для
удаления акриловой кислоты и других заряженных продуктов деградации. При хранении в
соответствии с рекомендациями, растворы акриламида/бисакриламида и твердый
персульфат стабильны в течение длительного времени.
Сборка кассет для формирования геля. Две стеклянные пластинки (например, размером
10 см×8 см), политетрафторэтиленовую гребенку, две прокладки и силиконовые трубки
(например, диаметром 0.6 мм и длиной 35 см) моют с мягким моющим средством и
промывают обильно водой, затем безводным этанолом, пластины высушивают при
комнатной температуре. Прокладки и трубки смазывают несиликоновой смазкой.
Прокладки укладывают вдоль двух коротких сторон стеклянных пластин на расстоянии 2
мм от их краев и 2 мм от длинной стороны, являющейся дном для геля. Используя одну
прокладку в качестве основы, начинают укладывать трубку. Осторожно просовывают
трубку книзу прокладки и протягивают вдоль длинной стороны стеклянной пластинки.
Придерживая трубку вдоль длинной стороны пластинки, укладывают трубку по короткой
стороне стеклянной пластинки, используя прокладку в качестве направляющей. Накрывают
другой стеклянной пластинкой, плотно прижимая кассету руками. Устанавливают по два
зажима на две короткие стороны кассеты. Осторожно устанавливают четыре зажима на
длинную сторону кассеты геля, формируя дно кассеты. Необходимо убедиться, что трубка
проходит вдоль края стеклянной пластинки и нигде не выдавлена при закреплении
зажимов. Форма готова для заливки геля.
Приготовление геля. В случае прерывистого буферного натрия додецилсулфат-
полиакриламидного геля рекомендуют залить разделяющий гель, дать ему застыть, а затем
залить концентрирующий гель, т.к. гели отличаются содержанием
акриламидабисакриламида, буфером и рН.
Приготовление разделяющего геля. В конической колбе готовят соответствующий объем
раствора с необходимой концентрацией акриламида для формирования геля, используя
значения, приведенные в таблице 2.2.31.1. Компоненты смешивают в указанной
последовательности. Если необходимо, перед прибавлением раствора аммония персульфата
и тетраметилэтилендиамина раствор фильтруют под вакуумом через ацетатцеллюлозную
мембрану (диаметр пор 0.45 мкм); раствор выдерживают под вакуумом, взбалтывая
фильтрационное приспособление до окончания образования в растворе пузырьков.
Прибавляют соответствующее количество раствора аммония персульфата и
тетраметилэтилендиамина, как указано в таблице 2.2.31.1, взбалтывают и сразу заливают в
пространство между двумя пластинками кассеты. Оставляют необходимое место для
концентрирующего геля (к длине зубца гребенки прибавляют 1 см). Используя заостренную
стеклянную пипетку, осторожно наслаивают насыщенный водой раствор изобутанола. Гель
выдерживают в вертикальном положении при комнатной температуре для обеспечения
полимеризации.
Таблица 2.2.31.1. Приготовление разделяющего геля
Компоненты раствора
Объем компонента (мл) на 1 кассету геля вместимостью
5 мл
10 мл
15 мл
20 мл
25 мл
30 мл
40 мл
50 мл
6 % акриламид
Вода Р
2.6
5.3
7.9
10.6
13.2
15.9
21.2
26.5
Раствор акриламида
(1)
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
8.0
10.0
1.5 М Трис (рН 8.8)
(2)
1.3
2,5
3.8
5.0
6.3
7.5
10.0
12.5
Раствор 100 г/л НДС
(3)
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
Раствор 100 г/л АПС
(4)
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
ТЕМЭД
(5)
0.004
0.008
0.012
0.016
0.02
0.024
0.032
0.04
8 % акриламид
Вода Р
2.3
4.6
6.9
9.3
11.5
13.9
18.5
23.2
Раствор акриламида
(1)
1.3
2.7
4.0
5.3
6.7
8.0
10.7
13.3
1.5 М Трис (рН 8.8)
(2)
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10.0
12.5
Раствор 100 г/л НДС
(3)
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
Раствор 100 г/л АПС
(4)
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
ТЕМЭД
(5)
0.003
0.006
0.009
0.012
0.015
0.018
0.024
0.03
10 % акриламид
Вода Р
1.9
4.0
5.9
7.9
9.9
11.9
15.9
19.8
Раствор акриламида
(1)
1.7
3.3
5.0
6.7
8.3
10.0
13.3
16.7
1.5 М Трис (рН 8.8)
(2)
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10.0
12.5
Раствор 100 г/л НДС
(3)
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
Раствор 100 г/л АПС
(4)
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
ТЕМЭД
(5)
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.016
0.02
12 % акриламид
Вода Р
1.6
3.3
4.9
6.6
8.2
9.9
13.2
16.5
Раствор акриламида
(1)
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
16.0
20.0
1.5 М Трис (рН 8.8)
(2)
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10.0
12.5
Раствор 100 г/л НДС
(3)
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
Раствор 100 г/л АПС
(4)
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
ТЕМЭД
(5)
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.016
0.02
14 % акриламид
Вода Р
1.4
2.7
3.9
5.3
6.6
8.0
10.6
13.8
Раствор акриламида
(1)
2.3
4.6
7.0
9.3
11.6
13.9
18.6
23.2
1,5 М Трис (рН 8,8)
(2)
1.2
2.5
3.6
5.0
6.3
7.5
10.0
12.5
Раствор 100 г/л ДСН
(3)
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
Раствор 100 г/л АПС
(4)
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
ТЕМЭД
(5)
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.016
0.02
15 % акриламид
Вода Р
1.1
2.3
3.4
4.6
5.7
6.9
9.2
11.5
Раствор акриламида
(1)
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
20.0
25.0
1,5 М Трис (рН 8.8)
(2)
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10.0
12.5
Раствор 100 г/л НДС
(3)
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
Раствор 100 г/л АПС
(4)
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
ТЕМЭД
(5)
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.016
0.02
(1) Раствор акриламида: 30 % раствор акриламид-бисакриламида (29:1) Р.
(2) 1.5 М Трис (рН 8.8): 1.5 М буферный раствор трис-гидрохлорида рН 8.8 Р.
(3) Раствор 100 г/л НДС: раствор 100 г/л натрия додецилсульфата Р.
(4) Раствор 100 г/л АПС: раствор 100 г/л аммония персульфата Р. Под действием
аммония персульфата появляются свободные радикалы, ускоряющие полимеризацию
акриламида и бисакриламида. Поскольку раствор аммония персульфата быстро
разлагается, свежие растворы следует готовить ежедневно.
(5) ТЕМЭД: тетраметилэтилендиамин Р.
Приготовление концентрирующего геля. После завершения полимеризации (около 30 мин)
сливают изобутанол и промывают верхнюю поверхность геля несколько раз водой для
удаления нанесенного изобутанола и любых неполимеризованных излишков акриламида.
Сливают как можно больше жидкости с верхней поверхности геля, затем удаляют остатки
воды кончиком бумажной салфетки.
В конической колбе готовят соответствующий объем раствора с необходимой
концентрацией акриламида для формирования геля, используя значения, приведенные в
таблице 2.2.31.2. Компоненты смешивают в указанной последовательности. Если
необходимо, перед прибавлением раствора аммония персульфата и
тетраметилэтилендиамина раствор фильтруют под вакуумом сквозь ацетатцеллюлозную
мембрану (диаметр пор 0.45 мкм); раствор выдерживают под вакуумом, встряхивая
фильтрационное приспособление до окончания образования в растворе пузырьков.
Прибавляют соответствующее количество раствора аммония персульфата и
тетраметилэтилендиамина, как указано в таблице 2.2.31.2, взбалтывают и сразу заливают в
пространство между двумя пластинками кассеты прямо на поверхность полимеризованного
разделяющего геля. В раствор концентрирующего геля сразу вкладывают чистую
политетрафторэтиленовую гребенку во избежание появления воздушных пузырьков.
Прибавляют еще раствор концентрирующего геля до полного заполнения пространства
гребенки. Гель выдерживают в вертикальном положении при комнатной температуре для
обеспечения полимеризации.
Приготовление образцов. Если иное не указано в частной монографии, образцы могут
быть приготовлены следующим образом:
Приготовление образцов (невосстанавливающие условия). Смешивают равные объемы
смеси, состоящей из воды Р и испытуемого препарата или стандартного образца, и
концентрированного буферного раствора для приготовления образцов при электрофорезе
в полиакриаламидном геле в присутствии натрия додецилсульфата Р.
Приготовление образцов (восстанавливающие условия). Смешивают равные объемы смеси,
состоящей из воды Р и испытуемого препарата или стандартного образца, и
концентрированного буферного раствора для приготовления образцов для
восстанавливающих условий при электрофорезе в полиакриаламидном геле в присутствии
натрия додецилсульфата Р, содержащего 2- меркаптоэтанол (или ДТТ) в качестве
восстановителя. Концентрация, указанная в монографии, может варьироваться в
зависимости от белка и метода окрашивания.
Обработка образца: выдерживают на водяной бане или в блок-нагревателе при температуре
100 °С в течение 5 мин, затем охлаждают. Температура и время, указанные в частной
монографии могут варьировать, так как во время термической обработки может
происходить расщепление белка.
Установка геля в аппарат для электрофореза и электрофоретическое разделение.
После завершения полимеризации (около 30 мин), осторожно удаляют
политетрафторэтиленовый гребень. Немедленно промывают лунки водой или буферным
раствором для электрофореза в полиакриаламидном геле в присутствии натрия
додецилсульфата Р для удаления неполимеризованного акриламида. При необходимости
выравнивают перегородки концентрирующего геля тупой иглой для подкожных инъекций,
надетой на шприц. Снимают зажимы с одной короткой стороны, осторожно вытягивают
трубку и возвращают зажимы на место. Повторяют эти операции с другой короткой
стороны. Затем удаляют трубку со дна геля. Помещают гель в прибор для электрофореза.
Верхний и нижний резервуары наполняют буферным раствором для электрофореза.
Удаляют все пузырьки, образующиеся да дне геля между двумя стеклянными пластинками.
Для этих целей лучше всего использовать изогнутую иглу, надетую на шприц. Не следует
проводить первоначальный электрофорез до нанесения образцов, так как это приведет к
нарушению прерывистости буферной системы. Перед нанесением образцов осторожно
ополаскивают лунки буферным раствором для электрофореза в полиакриламидном геле в
присутствии натрия додецилсульфата Р. Готовят испытуемые растворы и растворы
сравнения в рекомендованном буферном растворе для образцов и обрабатывают, как
указано в частной монографии. Наносят необходимое количество каждого раствора в лунки
концентрирующего геля. Начинают электрофорез в условиях, указанных в инструкции к
прибору. Изготовители НДС-ПААГ приборов могут поставлять гели разных размеров и
толщины. Для получения оптимального разделения необходимо подбирать время
проведения электрофореза, а также силу тока/напряжения соответственно с указанием
изготовителя приборов. Необходимо удостовериться, что фронт красителя доходит до
разделяющего геля. Когда краситель доходит до нижнего края геля, электрофорез
заканчивают. Кассету геля вынимают из прибора и осторожно разделяют стеклянные
пластинки. Удаляют прокладки, отрезают и отделяют концентрирующий гель и немедленно
окрашивают оставшийся гель.
Таблица 2.2.31.2. Приготовление концентрирующего геля
Компоненты раствора
Объем компонента (мл) на 1 кассету геля вместимостью
1 мл
2 мл
3 мл
4 мл
5 мл
6 мл
8 мл
10 мл
Вода Р
0.68
1.4
2.1
2.7
3.4
4.1
5.5
6.8
Раствор акриламида
(1)
0.17
0.33
0.5
0.67
0.83
1.0
1.3
1.7
1.5 М Трис (рН 6.8)
(2)
0.13
0.25
0.38
0.50
0.63
0.75
1.0
1.25
Раствор 100 г/л НДС
(3)
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.08
0.1
Раствор 100 г/л АПС
(4)
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.08
0.1
ТЕМЭД
(5)
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.008
0.01
(1) Раствор акриламида: 30 % раствор акриламид-бисакриламида (29:1) Р.
(2) 1.5 М Трис (рН 6.8): 1.5 М буферный раствор трис-гидрохлорида рН6.8 Р.
(3) Раствор 100 г/л НДС: раствор 100 г/л натрия додецилсульфата Р.
(4) Раствор 100 г/л АПС: раствор 100 г/л аммония персульфата Р. Под действием
аммония персульфата появляются свободные радикалы, ускоряющие полимеризацию
акриламида и бисакриламида. Поскольку раствор аммония персульфата быстро
разлагается, свежие растворы следует готовить ежедневно.
(5) ТЕМЭД: тетраметилэтилендиамин Р.
НДС-ПААГ - ГЕЛИ С ГРАДИЕНТНОЙ КОНЦЕНТРАЦИЕЙ
Градиентные гели (разделяющие гели) готовят с возрастающей концентрацией акриламида
сверху вниз. Для приготовления градиентных гелей требуется устройство для
формирования градиента. Готовые градиентные гели с рекомендованными протоколами
коммерчески доступны.
Градиентные гели обладают некоторыми преимуществами, так как позволяет разделять
белки, которые совместно мигрируют в гелях с фиксированной концентрацией акриламида.
Во время электрофореза белки мигрируют до тех пор, пока размер пор не препятствует их
дальнейшему продвижению и не возникнет эффект укладки, который приводит к
появлению более четких полос. Как показано в таблице 2.2.31–3, градиентные гели также
позволяют разделять белки с более широким диапазоном молекулярных масс по сравнению
с гелями с фиксированной концентрацией.
В таблице приведены рекомендованные составы линейного градиента, с сопоставлением
диапазона концентраций акриламида к соответствующим диапазонам молекулярных масс
белков. Необходимо учитывать, что могут быть приготовлены другие формы градиента
(например, вогнутые) для специального применения. Градиентные гели также применяются
для определения молекулярной массы и степени чистоты белка.
Таблица 2.2.31.3
Акриаламид (%) Диапазон молекулярных масс белка (кДа)
5 – 15 20 – 250
5 – 20 10 – 200
10 – 20 10 – 150
8 – 20 8 – 150
ОБНАРУЖЕНИЕ БЕЛКОВ В ГЕЛЯХ
Наиболее распространенными являются методы окрашивания белков красителем Кумасси и
серебром, подробно описанные ниже. Также коммерчески доступны другие красители,
методы обнаружения и наборы. Например, флуоресцентные красители используют с
флуоресцентным устройством, что обеспечивает линейный отклик в широком диапазоне
концентраций белка, часто на несколько порядков в зависимости от природы белка.
Окрашивание красителем Кумасси позволяет определять приблизительно от 1 мкг до 10
мкг белка в одной полосе. Окрашивание серебром представляет собой более
чувствительный метод окрашивания белка, при котором можно обнаружить полосы,
содержащие от 10 нг до 100 нг белка. Эти показатели считаются достижимыми для данной
окраски гелей. Иногда в литературе указывают чувствительность окрашивания серебром на
1 или 2 порядка выше.
Окрашивание по Кумасси обеспечивает более линейный сигнал, чем окрашивание
серебром, тем не менее сигнал и диапазон зависят от природы белка и времени проведения
электрофоретического разделения. Воспроизводимость при окрашивании красителем
Кумасси и серебром может уменьшаться, если окрашивание прекращают из субъективных
соображений, то есть в момент, когда оно кажется достаточным. Очень важно использовать
динамические диапазоны стандартных белков, так как они помогают оценить
чувствительность и линейность при проведении испытаний. Все стадии окрашивания геля
проводят в перчатках, при комнатной температуре, при осторожном встряхивании
(например, на платформе орбитального шейкера) и с использованием любого удобного
контейнера.
Окрашивание по Кумасси. Гель погружают в большой объем Кумасси окрашивающего
раствора Р и выдерживают в течение не менее 1 ч. Затем сливают окрашивающий раствор.
Гель обесцвечивают большим избытком обесцвечивающего раствора Р. Меняют
обесцвечивающей раствор Р несколько раз, до четкого проявления окрашенных полос
белка на прозрачном фоне. Чем тщательнее отмывают гель, тем меньше количество белка
может быть обнаружено с помощью метода подкрашивания. Обесцвечивание можно
ускорить, если добавить в раствор несколько граммов анионообменной смолы или
маленького кусочка пористого материала.
ПРИМЕЧАНИЕ: кислотно-спиртовые растворы, используемые в указанной методике, не
полностью фиксируют белки в геле. Это может привести к потере некоторых белков с
низкой молекулярной массой во время окрашивания и обесцвечивания тонких гелей.
Постоянная фиксация достигается, если выдержать гель в смеси из трихлоруксусной
кислоты Р, метанола Р и воды Р в соотношении (1: 4:5 об/ об/ об) в течение 1 ч, перед
погружением в Кумасси окрашивающий раствор Р.
Окрашивание серебром. Гель погружают в большой объем фиксирующего раствора Р и
выдерживают в течение 1 ч. Фиксирующий раствор сливают и добавляют новую порцию
фиксирующего раствора, выдерживают либо в течение не менее 1 ч или если возможно
оставляют на ночь. Затем фиксирующий раствор сливают и промывают гель в большом
избытке воды Р в течение 1 ч. Далее гель выдерживают в 1 % растворе глутарового
альдегида Р (об/об) в течение 15 мин. Промывают гель дважды в течение 15 мин в большом
избытке воды Р. Замачивают гель в свежеприготовленном реактиве серебра нитрата Р в
течение 15 мин в темноте. Затем трижды промывают гель по 5 мин большим избытком
воды Р. Гель выдерживают в растворе проявителя Р в течение около 1 мин до получения
удовлетворительного окрашивания. Проявление останавливают, помещая гель в
блокирующий раствор Р на 15 мин. Ополаскивают гель водой Р.
РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Гели фотографируют или сканируют, пока они еще влажные или после соответствующей
процедуры сушки. В настоящее время коммерчески доступны системы сканирования гелей,
оснащенные программным обеспечением для анализа данных и позволяющие немедленно
фотографировать и анализировать мокрые гели.
Гели обрабатывают в зависимости от используемого метода окрашивания. Для
окрашивания по Кумасси, после стадии обесцвечивания гель выдерживают в растворе 100
г/л глицерина Р не менее 2 ч (возможно инкубирование в течение ночи). При окрашивании
серебром на конечном стадии промывания гели выдерживают в растворе в 20 г/л глицерина
Р в течение 5 мин.
Высушивание окрашенных НДС-полиакриламидных гелей является одним из методов,
применяемых для получения долговременной документации. Этот метод часто приводит к
растрескиванию геля во время сушки между целлюлозными пленками.
Два листа пористой целлюлозной пленки погружают в воду Р и выдерживают в течение 5 -
10 мин. Растягивают один из листов пленки на рамке для высушивания. На натянутую
целлюлозную пленку аккуратно помещают пропитанный в растворе гель, удаляют все
случайно попавшие воздушные пузыри и наливают несколько миллилитров воды Р по
краям геля. Помещают второй лист сверху и снова удаляют все попавшие воздушные
пузыри, заканчивают сборку рамки для сушки геля и помещают ее в сушильный шкаф или
оставляют при комнатной температуре до полного высыхания.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ
Молекулярные массы белков определяют, сравнивая их подвижность с подвижностью
нескольких маркерных белков с известной молекулярной массой. Для калибровки гелей
доступны смеси из предварительно окрашенных и неокрашенных белков с точно
известными молекулярными массами, смешанными для равномерного окрашивания. Они
доступны в различных диапазонах молекулярных масс. Концентрированные исходные
растворы белков с известной молекулярной массой разводят соответствующим буферным
раствором образца и наносят на тот же гель, что и испытуемый образец белка.
Сразу же после прогона на геле отмечают положение красителя бромфенолового синего для
определения переднего края электрофоретического фронта ионов. Это можно сделать
нанесением надреза края геля или путем прокола геля у фронта красителя иглой,
предварительно смоченной в черной туши или другом подходящем контрастном
красителе. После окрашивания измеряют расстояние миграции каждой полосы белка
(маркеров и испытуемых образцов) от верхней части разрешающего геля. Вычисляют
отношение расстояния миграции каждого белка к расстоянию, пройденному красителем.
Нормализованные расстояния миграции называются относительными подвижностями
белков (относительно фронта красителя), и обозначаются R
F
. Строят график зависимости
логарифма относительных молекулярных масс (M
r
) белковых стандартных образцов от
полученных значений R
F
. Неизвестные молекулярные массы определяют с помощью
метода линейного регрессионного анализа (или, более точно, нелинейного регрессионного
анализа) или интерполяцией кривых зависимости log M
r
от R
F
, если значения, полученные
для испытуемых образцов, приблизительно располагаются вдоль линейной части графика.
ВАЛИДАЦИЯ ИСПЫТАНИЯ
Результаты испытаний признают достоверными, если требуемый диапазон разрешения
геля подтвержден распределением маркерных белков с известными молекулярными
массами, например, на протяжении 80 % длины геля. Разделение, полученное для
маркерных белков должно показать линейную зависимость логарифма молекулярной массы
от R
F
. Если график имеет сигмовидную форму, то в расчетах можно использовать только
данные из линейной области кривой. В частных монографиях могут быть указаны
дополнительные требования к валидации по отношению к испытуемому образцу.
Чувствительность также должна быть валидирована. Для проверки пригодности системы
может применяться стандартной образец белка с концентрацией, соответствующей
необходимому пределу, анализируемый параллельно с испытуемыми образцами.
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСЕЙ
НДС-РААГ часто используется при проведении испытания на предельное содержание
примеси. В случае, если содержание примесей определяется методом нормализации и по
отношению к основной полосе с использованием денситометрического интегрирования или
анализа изображения, линейность сигнала должна быть валидирована. Необходимо
учитывать, что в зависимости от метода обнаружения и белка, как описано во введении к
разделу 5-3, диапазон линейности может варьировать, но он должен быть определен при
каждом испытании с использованием одного или нескольких контрольных образцов,
содержащих белки в соответствующем диапазоне концентрации.
Если предельное содержание примесей указано в частной монографии, в испытании
необходимо использовать раствор сравнения, соответствующий этому уровню содержания
примеси, приготовленный путем разведения испытуемого раствора.
Например, если предельное содержание примесей составляет 5 %, раствор сравнения
должен быть приготовлен путем разведения испытуемого раствора в соотношении 1:20. На
электрофореграмме испытуемого раствора ни одна полоса, кроме основной, не должна
быть интенсивнее, основной полосы, полученной с раствором сравнения.
Для валидированной методики содержание примесей может быть количественно
определено методом внутренней нормализации по отношению к основной полосе с
использованием интегрирующего денситометра или путем анализа изображений. При
валидации методики должна быть подтверждена линейность.