3/1:20429
2.4.29. ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫЕ ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ В МАСЛАХ
СОДЕРЖАЩИХ ОМЕГА-3 КИСЛОТЫ
Испытание может быть использовано для количественного определения
эйкозапентаеновой кислоты, докозагексаеновой кислоты и общего содержания омега-3-
полиненасыщенных жирных кислот в лекарственных средствах с различной
концентрацией омега-3 кислот в форме триглицеридов и сложных эфиров. Метод
применим к триглицеридам и этиловым эфирам. В форме триглицеридов омега-3 кислоты
содержатся в продуктах из рыбьего жира, жира печени рыб, маслах водорослей и
концентратах омега-3 кислот. Результаты испытания выражают как содержание
триглицеридов или этиловых эфиров.
ЭЙКОЗАПЕНТАЕНОВАЯ КИСЛОТА И ДОКОЗАГЕКСАЕНОВАЯ КИСЛОТА
Для количественного определения омега-3-полиненасыщенных жирных кислот применяют
метод газовой хроматографии с пламенно-ионизационной детекцией (2.2.28). Испытания
необходимо выполнять как можно быстрее, не допуская воздействия актиничного света,
окислителей, катализаторов окисления (например, меди и железа) и воздуха.
Испытание проводят с этиловыми эфирами (all-Z)-эйкоза-5,8,11,14,17-пентаеновой кислоты
(эйкозапентаеновая кислота; С20:5 n-3) и (all-Z)-докоза-4,7,10,13,16,19-гексаеновой
кислоты (докозагексаеновая кислота; С22:6 n-3) или метиловыми эфирами (после
дериватизации триглицеридов - стадия B) в испытуемых образцах.
Внутренний стандарт: метилтрикозаноат Р.
Все испытуемые растворы готовят в двух повторностях.
Стадия А
Испытуемый раствор (а). Навеску испытуемого образца в соответствии с таблицей 2.4.29.-
1 и 70.0 мг внутреннего стандарта растворяют в растворе 50 мг/л бутилгидрокситолуола Р
в триметилпентане Р и доводят объем тем же раствором до 10.0 мл. Для растворения
внутреннего стандарта допускается слабое нагревание до температуры 60 °С. Полученный
раствор используют для проведения испытаний на этиловые эфиры. Для определения
триглицеридов испытание продолжить согласно стадии B.
Таблица 2.4.29.-1.
Приблизительная сумма ЭПК + ДГК
(%)
Навеска испытуемого образца
(г)
30 – 50
0.4 – 0.5
50 – 70
0.3
70 – 90
0.25
Испытуемый раствор (b). Навеску испытуемого образца в соответствии с таблицей 2.4.29.-
1 растворяют в растворе 50 мг/мл бутилгидрокситолуола Р в триметилпентане Р и
доводят объем тем же раствором до 10.0 мл. Полученный раствор используют для
проведения испытаний на этиловые эфиры. Для определения триглицеридов испытание
продолжить согласно стадии B.
Стадия B
Затем в отдельные кварцевые пробирки вводят по 2.0 мл испытуемых растворов (a) и (b),
полученных на этапе A. Для испарения растворителя через растворы пропускают слабый
поток азота Р. Добавляют 1.5 мл натрия гидроксида раствор Р (20 г/л) в метаноле Р,
создают над раствором прослойку азота Р, плотно закрывают пробкой ламинированною
политетрафторэтиленом, тщательно перемешивают и нагревают на водяной бане в течение
7 мин. Оставляют для охлаждения. В остывшие пробирки добавляют 2 мл раствора бора
трихлорида в метаноле Р, вновь создают прослойку азота Р, плотно закрывают пробкой,
тщательно перемешивают и нагревают на водяной бане в течение 30 мин. Охлаждают до
температуры (40 – 50) °C. Добавляют 1 мл триметилпентана Р, покрывают слоем азота Р,
закрывают пробкой и энергично перемешивают не менее 30 с. Немедленно добавляют 5 мл
натрия хлорида насыщенный раствор Р, покрывают азотом Р, закрывают пробкой и
тщательно перемешивают не менее 15 с. Переносят количественно верхний слой в
отдельную пробирку. В оставшийся раствор добавляют 1 мл триметилпентана Р,
перемешивают и повторяют перенос. Объединенные экстракты триметилпентана
промывают двумя порциями воды Р по 1 мл и высушивают над натрия сульфат безводный
Р. Для высушивания на дно эксикатора помещают натрия сульфат безводный Р, сверху
устанавливают решетку, на которой размещают открытые пробирки, плотно закрывают
эксикатор и выдерживают до появления сухого остатка.
Растворы сравнения: растворы сравнения (a1) и (a2) готовят в двух повторностях; раствор
сравнения (b) готовят только для триглицеридов в том случае, если на хроматограмме
испытуемого раствора (а) явно не обнаруживается пик метилового эфира тетракоз-15-
еновой кислоты.
– раствор сравнения (а1). Растворяют 70.0 мг внутреннего стандарта и 90.0 мг СО
этилового эфира эйкозапентаеновой кислоты в растворе 50 мг/л бутилгидрокситолуола
Р в триметилпентане Р и доводят объем тем же раствором до 10.0 мл. Для растворения
внутреннего стандарта допускается слабое нагревание до температуры 60 оС.
– раствор сравнения (а2). 60.0 мг СО этилового эфира докозагексаеновой кислоты и 70.0
мг внутреннего стандарта растворяют в растворе 50 мг/л бутилгидрокситолуола Р в
триметилпентане Р и доводят объем тем же раствором до 10.0 мл. Для растворения
внутреннего стандарта допускается слабое нагревание до температуры 60 оС.
Для определения этиловых эфиров растворы сравнения (a1) и (a2) готовы. Для определения
триглицеридов, продолжить стадию B таким же образом, как для испытуемых образцов (a)
и (б).
– раствор сравнения (b). 0.300 г метиларахидата Р, 0.300 г метилбегената Р, 0.300 г
метилпальмитата Р и 0.300 г метилстерата Р растворяют в растворе 50 мг/л
бутилгидрокситолуола Р в триметилпентане Р и доводят объем тем же раствором до
10.0 мл;
– раствор сравнения (с). Навеску, содержащую 55.0 мг метилового эфира докозагексаеновой
кислоты Р и 5.0 мг метилового эфира тетракоз-15-еновой кислоты Р растворяют в
растворе 50 мг/л бутилгидрокситолуола Р в триметилпентане Р и доводят объем тем же
раствором до 10.0 мл.
Условия хроматографирования:
– колонка: капиллярная, из термостойкого кварца длиной не менее 25 м и внутренним
диаметром 0.25 мм, покрытая макроголом 20 000 Р толщиной 0.2 мкм;
– газ-носитель: водород для хроматографии Р или гелий для хроматографии Р;
– скорость газа-носителя: 1 мл/мин;
– детектор: пламенно-ионизационный;
– объем вводимой пробы: 1 мл;
– деление потока: 1:200, в качестве альтернативы - введение без деления потоков с
контролем температуры (в этом случае необходимо перед введением испытуемые
растворы развести 1/200 раствором 50 мг/л бутилгидрокситолуола Р в
триметилпентане Р).
При необходимости корректируют скорость потока и (или) разведение образца таким
образом, чтобы достигнуть коэффициента симметрии 0.8 – 1.5 для пиков метиловых или
этиловых эфиров эйкозапентаеновой кислоты и докозагексаеновой кислоты, при этом на
хроматограмме испытуемого раствора (b) должны отчетливо обнаруживаться пики, относя-
щиеся к соответствующим эфирам (линоленовой кислоты (C18:3n-3), стеаридоновой кис-
лоты (C18:4 n-3), эйкозатетраеновой кислоты (C20:4 n-3), геникозапентаеновой кислоты
(C21:5 n-3) и докозапентаеновой кислоты (C22:5 n-3)). В случае невыполнения требова-
ний, приоритет имеют четкие обнаружения соответствующих сложных эфиров, представ-
ленных выше для испытуемого раствора (b).
При необходимости, для получения коэффициента симметрии 0.8 – 1.5 для пиков,
обусловленных компонентами раствора сравнения (b), корректируют скорость потока и
(или) разбавление образца.
– режим изменения температуры:
С делением потока
Без деления потока
Время
(мин)
Температура
(°C)
Время
(мин)
Колонка
0 – 2
170
0 – 2
2 – 25.7
170 → 240
2 – 4.7
25.7 – 28
240
4.7 – 28
28 – 30
Блок ввода проб
(инжектор)
250
Детектор
270
*90 °C при введении непосредственно в начало колонки
Пригодность хроматографической системы:
– на хроматограмме раствора сравнения (b) площади пиков компонентов метилпальмитата,
метилстеарата, метиларахидата и метилбегената изменяются в соответствии с
коэффициентами чувствительности, представленными в таблице 2.4.29.−2 (площадь
пика умножается на коэффициент чувствительности); после применения метода
нормализации, откорректированные площади пиков метиловых эфиров жирных кислот
принимают за 100 процентов; нормализированное процентное содержание площади
каждого метилового эфира жирной кислоты должны быть в пределах (±1) процента от
соответствующего массового процента;
Таблица 2.4.29.-2.
Метиловые эфиры жирных кислот
Коэффициент чувствительности
Метилпальмитат
1.049
Метилстеарат
1.029
Метиларахидат
1.013
Метилбегенат
1
– разрешение:
– этиловые эфиры: не менее 1.2 между пиками метилтрикозаноата и этилового эфира
геникозапентаеновой кислоты на хроматограмме раствора сравнения (а);
– триглицериды: не менее 1.2 между пиками метилового эфира докозагексаеновой
кислоты и метилового эфира тетракоз-15-еновой кислоты на хроматограмме
испытуемого раствора (а) или раствора сравнения (с);
– на хроматограмме, полученной с помощью испытуемого раствора (a), пики метил-
трикозаноата и метилового эфира геникозапентаеновой кислоты при сравнении с
хроматограммой, полученной с помощью испытуемого раствора (b) должны быть
полностью разделены.
Содержание эйкозапентаеновой кислоты и докозагексаеновой кислоты в процентах с уче-
том их содержания в стандартных образцах рассчитывают по формуле:
󰇛
󰇜   
где:
Rf – коэффициент чувствительности для эйкозапентаеновой кислоты и докозагексаеновой
кислоты, рассчитанный по формуле:


где:
m1 − масса внутреннего стандарта в испытуемом растворе (а) в миллиграммах;
m2 − масса испытуемого образца в испытуемом растворе (а) в миллиграммах;
mx,3 − масса внутреннего стандарта в растворе сравнения (а1) (для определения
эйкозапентаеновой кислоты) или в растворе сравнения (а2) (для определения
докозагексаеновой кислоты), в миллиграммах;
mx,r − масса СО этилового эфира эйкозапентаеновой кислоты в растворе сравнения (а1)
или СО этилового эфира докозагексаеновой кислоты в растворе сравнения (а2), в
миллиграммах;
Ax − площадь пика этилового эфира эйкозапентаеновой кислоты или этилового эфира
докозагексаеновой кислоты на хроматограмме испытуемого раствора (а);
Ax,r − площадь пика этилового эфира эйкозапентаеновой кислоты на хроматограмме
раствора сравнения (а1) или этилового эфира докозагексаеновой кислоты на
хроматограмме раствора сравнения (а2);
A1 − площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора (а);
Ax,3 − площадь пика внутреннего стандарта на хроматограммах раствора сравнения (а1)
(для определения эйкозапентаеновой кислоты) или раствора сравнения (а2) (для
определения докозагексаеновой кислоты);
К − коэффициент пересчета между этиловыми эфирами и триглицеридами:
Этиловые эфиры К – 1.00
Триглицериды К – 0.954 для эйкозапентаеновой кислоты;
К – 0.957 для докозагексаеновой кислоты.
ОБЩЕЕ СОДЕРЖАНИЕ ОМЕГА-З-КИСЛОТ
На основании полученных результатов количественного определения эйкозапентаеновой
кислоты и докозагексаеновой кислоты рассчитывают общее содержание омега-3-кислот в
процентах по формуле:
ЭПК + ДГК + 󰇛󰇜

где:
ЭПК ‒ содержание эйкозапентаеновой кислоты в процентах;
ДГК ‒ содержание докозагексаеновой кислоты в процентах;
Аn-3 ‒ сумма площадей пиков, соответствующих эфирам линоленовой кислоты (С18:3
n-3), стеаридоновой кислоты (С18:4 n-3), эйкозатетраеновой кислоты (С20:4 n-
3), геникозапентаеновой кислоты (C21:5 n-3) и докозапентаеновой кислоты
(C22:5 n-3) на хроматограмме испытуемого раствора (b);
АЭПК ‒ площадь пика этилового эфира ЭПК на хроматограмме испытуемого раствора
(b);
АДГК
‒ площадь пика этилового эфира ДГК на хроматограмме испытуемого раствора (b).