2.6. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ
3/1:20601
2.6.1. СТЕРИЛЬНОСТЬ
Испытание применяют для субстанций для фармацевтического применения,
вспомогательных веществ, лекарственных средств, включая биологические
лекарственные препараты и их растворители, которые в соответствии с требованиями
фармакопеи должны быть стерильными. Однако удовлетворительный результат
испытания только указывает, что в данных условиях испытания в испытуемом образце
не обнаружены жизнеспособные микроорганизмы
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРОТИВ КОНТАМИНАЦИИ
Испытание на стерильность проводят в асептических условиях. Для обеспечения таких
условий, окружающая среда должна быть адаптирована к способу испытания на
стерильность. Меры, предотвращающие контаминацию, не должны оказывать влияния ни
на один из микроорганизмов, обнаруживаемых в ходе испытания. Условия проведения
испытания регулярно контролируют путем соответствующего отбора проб в рабочей зоне
и проведением соответствующих контрольных испытаний.
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И ТЕМПЕРАТУРА ИНКУБАЦИИ
Среды для проведения испытаний могут быть приготовлены, как описано ниже, или
можно использовать подходящие коммерчески доступные среды при условии, что они
выдерживают испытания на стимуляцию роста.
Установлено, что нижеперечисленные питательные среды являются подходящими для
испытания на стерильность. Жидкая тиогликолевая среда, в первую очередь,
предназначена для культивирования анаэробных бактерий, но может быть использована
для обнаружения аэробных бактерий. Соево-казеиновая среда подходит для
культивирования как грибов, так и аэробных бактерий.
Жидкая тиогликолевая среда
L-цистин
0.5 г
Агар
0.75 г
Натрия хлорид
2.5 г
Глюкозы моногидрат/ глюкоза
5.5 г/5.0 г
Дрожжевой экстракт (водорастворимый)
5.0 г
Панкреатический гидролизат казеина
15.0 г
Натрия тиогликолята или тиогликолевая кислота
0.5 г
0.3 г
Раствор резазурина натрия (1 г/л), свежеприготовленный
1.0 мл
Вода Р
1000.0 мл
2
Значение рН после стерилизации 7.1 ± 0.2
Смешивают L-цистин, агар, натрия хлорид, глюкозу, дрожжевой экстракт
водорастворимый и панкреатический гидролизат казеина с водой Р и нагревают до
полного растворения. После этого в полученную смесь вносят натрия тиогликолят или
тиогликолевую кислоту и, если необходимо, доводят рН среды 1 М раствором натрия
гидроксида до необходимого значения. При необходимости фильтрации раствор снова
нагревают, не доводя до кипения, и фильтруют в горячем виде через увлажненный
бумажный фильтр. Прибавляют раствор резазурина натрия, перемешивают, и затем
разливают в ѐмкости соответствующего объема. Ёмкости должны обеспечивать такое
соотношение поверхности питательной среды к ее глубине, чтобы к концу периода
инкубации изменение окраски среды, указывающее на увеличение концентрации
кислорода, наблюдалось не более чем в верхней части объема среды. Смесь стерилизуют с
использованием валидированной процедуры. Хранят среду при температуре от 2 °С до 25
°С в стерильной герметичной ѐмкости. Если более одной верхней трети от общего объема
среды приобретает розовою окраску, среду можно однократно восстановить нагреванием
ѐмкости на водяной бане или в струе пара до исчезновения розовой окраски с
последующим быстрым охлаждением и соблюдением мер предосторожности от
попадания в ѐмкость нестерильного воздуха. Среду не используют по истечении
валидированных сроков хранения.
Жидкую тиогликолевую среду инкубируют при температуре от 30 °С до 35 °С.
Для продуктов, содержащих ртутный консервант, которые не могут быть проверены
методом мембранной фильтрации, вместо соево-казеиновой среды можно использовать
жидкую тиогликолевую среду, инкубированную при температуре от 20 °C до 25 °C, при
условии, что данная среда валидирована в соответствии с испытанием на ростовые
свойства. При наличии указаний или обоснований, возможно использование
альтернативной тиогликолевой среды, имеющей такой же состав, что и жидкая
тиогликолевая среда, за исключением агара и раствора резазурина натрия. Полученную
смесь стерилизуют, как указано выше. Значение рН после стерилизации должно быть 7.1
± 0.2. Перед использованием смесь нагревают на водяной бане и инкубируют при
температуре от 30 °C до 35 °C в анаэробных условиях.
Жидкая соево-казеиновая среда
Твердые компоненты растворяют в воде Р, при необходимости слегка нагревая. Раствор
охлаждают при комнатной температуре, при необходимости, прибавляют такое
количество 1 М раствор натрия гидроксида, чтобы после стерилизации значение рН
среды было 7.3 ± 0.2. Раствор, при необходимости, фильтруют для получения прозрачной
Панкреатический гидролизат казеина
17.0 г
Папаиновый гидролизат соевой муки
3.0 г
Натрия хлорид
5.0 г
Калия гидрофосфат
2.5 г
Глюкоза моногидрат / глюкоза безводная
2.5 г/2.3 г
Вода Р
1000.0 мл
Значение рН после стерилизации 7.3 ± 0.2
3
среды, разливают в подходящие ѐмкости и стерилизуют. Среду хранят при температуре от
2 °C до 25 °C в стерильной герметичной ѐмкости, если она не предназначена для
немедленного использования.
Соево-казеиновую среду инкубируют при температуре от 20 °С до 25 °С. Соево-
казеиновая среда должна выдерживать следующие испытания, проводимые до или
одновременно с контролем испытуемого образца.
Стерильность. После стерилизации не менее 5 % ѐмкостей от каждой cерии
питательной среды инкубируют в течение 14 сут. Рост микроорганизмов должен
отсутствовать.
Определение ростовых свойств питательных сред. Испытанию подвергают каждую
серию готовой питательной среды, в том числе серии, приготовленные из
лиофилизированных компонентов. Подходящие для испытания штаммы
микроорганизмов представлены в таблице 2.6.1.−1.
Таблица 2.6.1.−1. – Тест-штаммы микроорганизмов, подходящие для испытания
ростовых свойств питательных сред и проверки пригодности методики испытаний
Аэробные бактерии
Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
или
Bacillus cereus
Pseudomonas aeruginosa
Анаэробные бактерии
Clostridium sporogenes
Грибы
Candida albicans
Aspergillus brasiliensis
Каждый вид микроорганизма в количестве не более 100 КОЕ вносят в отдельную порцию
испытуемой среды. Жидкую тиогликолевую среду инокулируют микроорганизмами:
Clostridium sporogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. Соево-казеиновую
среду инокулируют микроорганизмами: Aspergillus brasiliensis, Bacillus subtilis, Candida
albicans. Инкубируют не более трех дней в случае бактерий и не более 5 дней в случае
грибов.
Число пассажей рабочих культур не должно превышать пяти пассажей от исходной
посевной культуры.
Питательную среду считают пригодной для использования, если в течение необходимого
времени инкубации в ней визуально наблюдают рост микроорганизмов.
ПРОВЕРКА ПРИГОДНОСТИ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ
4
Проверку пригодности проводят по методике, представленной в разделе Испытания на
стерильность испытуемого образца, со следующими изменениями.
Мембранная фильтрация. После переноса требуемого количества испытуемого образца
на фильтр в последнюю порцию стерильной жидкости для промывания добавляют
небольшое количество тест-штаммов жизнеспособных микроорганизмов (не более 100
КОЕ).
Метод прямого посева. Метод прямого посева используют для испытания на
стерильность лекарственных средств, не обладающих антимикробным действием, или тех
образцов, испытание которых невозможно выполнить методом мембранной фильтрации.
После переноса требуемого количества испытуемого образца в питательную среду
добавляют небольшое количество тест-штаммов жизнеспособных микроорганизмов (не
более 100 КОЕ).
В обоих случаях используют тест-штаммы, представленные в разделе Определение
ростовых свойств питательных сред. В качестве положительного контроля используют
испытание на ростовые свойства. Продолжительность инкубации всех ѐмкостей с
испытуемой средой не должно быть более 5 сут.
Если после инкубации получен отчетливо видимый рост микроорганизмов, визуально
сравнимый с ростом микроорганизмов в контрольной емкости без испытуемого образца,
делают вывод, что испытуемый образец в данных условиях испытания либо не обладает
антимикробной активностью, либо такая активность была в достаточной мере устранена.
После этого испытание на стерильность может проводиться без дальнейших изменений.
Если в присутствии испытуемого образца не получен отчетливо видимый рост, визуально
сравнимый с ростом микроорганизмов в контрольной емкости без испытуемого образца,
делают вывод, что испытуемый образец обладает в данных условиях антимикробной
активностью, которая не была в достаточной мере устранена в данных условиях
испытания. Необходимо изменить условия испытания для исключения антимикробной
активности и повторить проверку пригодности методики.
Проверку пригодности методики испытания (определение антимикробного действия)
проводят в следующих случаях:
а) при проведении испытания на стерильность нового лекарственного средства;
b) при внесении любых изменений в экспериментальные условия испытания;
с) в случае изменения состава лекарственного средства или при изменениях в технологии
его производства.
Проверка пригодности методики можно выполнять одновременно с испытанием на
стерильность испытуемого образца.
ИСПЫТАНИЕ НА СТЕРИЛЬНОСТЬ
Испытание на стерильность может быть выполнено методами мембранной фильтрации
или прямого посева на питательную среду. В испытание включают соответствующие
отрицательные контроли. Метод мембранной фильтрации используют во всех случаях,
когда физико-химические свойства испытуемого образца позволяют фильтровать его
5
через мембранные фильтры, то есть для водных, спиртовых или масляных лекарственных
средств, смешиваемых или растворимых в водных или масляных растворителях, не
обладающих антимикробным эффектом в условиях испытания.
Мембранная фильтрация. Процедура испытания на стерильность методом мембранной
фильтрации состоит из следующих основных стадий:
– смачивание мембран;
– подготовка образцов и фильтрация содержимого всех емкостей через мембранные
фильтры;
– отмывка мембранных фильтров соответствующим стерильным раствором;
– добавление питательной среды и инкубирование посевов.
Испытание выполняют с использованием мембранных фильтров с размером пор не более
0.45 мкм, способные к удержанию микроорганизмов. Например, фильтры на основе
нитрата целлюлозы используют для водных, масляных и разбавленных спиртовых
растворов, а фильтры на основе ацетата целлюлозы – для растворов с высоким
содержанием спирта и кислот. Для некоторых видов лекарственных средств, например,
для антибиотиков могут потребоваться специальные фильтры.
В методике, представленной ниже, предполагается использование мембран с диаметром
50 мм. При использовании фильтров других диаметров объемы разведений и отмывок
должны быть скорректированы соответствующим образом.
Фильтрационную установку и мембрану стерилизуют подходящими средствами.
Конструкция фильтрационной установки должна быть обеспечивать асептические
условия при внесении и фильтрации испытуемого раствора, переносе мембранного
фильтра в питательную среду или проведении инкубации после помещения питательной
среды в установку.
Водные растворы. При необходимости небольшое количество подходящего стерильного
растворителя, например нейтрального раствора мясного или казеинового пептона с
концентрацией 1 г/л (рН 7.1 ± 0.2), помещают на мембраны установки и фильтруют.
Растворитель может содержать подходящие нейтрализующие и/или инактивирующие
вещества, например, для испытания антибиотиков.
Содержимое первичных упаковок с испытуемым образцом переносят на мембранный
фильтр после разбавления специально подобранным стерильным растворителем до
объема, используемого при проверке пригодности методики испытания. Для посева на
соответствующую питательную среду используют испытуемый образец в количестве,
приведенном в таблице 2.6.1.−2. Немедленно фильтруют. Если испытуемый образец
обладает антимикробными свойствами, мембрану промывают не менее трех раз путем
пропускания через нее объема выбранного растворителя, используемого при проверке
пригодности методики испытания. Отмывочный цикл не должен превышать пяти раз по
100 мл на фильтр, даже если при проверке пригодности методики было показано, что
такой цикл не полностью устраняет антимикробную активность. Мембрану целиком
переносят в питательную среду или в асептических условиях делят ее на две равные
части, каждую из которых помещают в две подходящие среды. Используют такие же
объѐмы питательных сред, как и при проверке пригодности методики испытания.
Альтернативно питательную среду вносят непосредственно в установку.
6
Среды инкубируют не менее 14 сут.
Таблица 2.6.1.-2. Минимальное количество испытуемого образца для посева на
питательные среды
Количество в емкости
Минимальное количество, которое следует
использовать на каждую среду *
Жидкие лекарственные формы
Менее 1 мл
Все содержимое каждой емкости
От 1мл до 40 мл
1/2 содержимого каждой емкости, но не
менее 1 мл
Более 40 мл , но не более 100 мл
20 мл
Более 100 мл
10 % содержимого емкости, но не менее 20
мл
Жидкие лекарственные формы,
содержащие антибиотики
1 мл
Нерастворимые лекарственные
средства, кремы и мази,
суспендированные или эмульгируемые
Содержимое каждой емкости, но не менее
200 мг
Твердые лекарственные формы
Менее 50 мг
Все содержимое каждой ѐмкости
50 мг и более, но менее 300 мг
1/2 содержимого каждой ѐмкости, но не
менее 50 мг
Более 5 г
500 мг
Кетгут и другие шовные материалы для
ветеринарного использования
3 отрезка нити (каждая длинной 30 см)
* При отсутствии другого обоснования или разрешения уполномоченного органа
Твердые лекарственные формы, растворимые. Для каждой питательной среды
используют испытуемый образец в количестве, приведенном в таблице 2.6.1.−2.,
растворенного в подходящем растворителе. Например, в растворителе прилагаемом к
лекарственному средству, воде для инъекций, 0.9 % растворе натрия хлорида или
нейтральном растворе мясного или казеинового пептона с концентрацией 1 г/л, и
приводят испытание по методике, представленной выше для водных растворов, с
использованием мембранного фильтра, подходящего выбранному растворителю.
Масла и масляные растворы. Для каждой питательной среды используют испытуемый
образец в количестве, приведенном в Таблице 2.6.1.−2.. Масла и масляные растворы
достаточно низкой вязкости, могут быть отфильтрованы без разбавления через сухую
мембрану. Вязкие масла растворяют, при необходимости, в подходящем стерильном
7
растворителе, например, изопропилмеристате, не обладающем антимикробной активностью
в условиях испытания. Дают маслу пропитать мембрану под действием собственной
тяжести, затем фильтруют, постепенно увеличивая давление или вакуум. Мембрану
промывают, фильтруя через нее не менее трех порций, примерно по 100 мл каждая,
подходящего стерильного растворителя, например, нейтрального раствора мясного или
казеинового пептона, с концентрацией 1 г/л, содержащего подходящий эмульгатор в
концентрации приемлемость которой была подтверждена в ходе проверки пригодности
методики испытания, например полисорбата 80 с концентрацией 10 г/л. Мембрану переносят
на питательную среду (или наоборот), в соответствии с указаниями, приведенными выше для
водных растворов, и инкубируют при таких же температурах в течение тех же промежутков
времени.
Мази и кремы. Для каждой питательной среды используют испытуемый образец в
количестве, приведенном в таблице 2.6.1.−2. Мази на жировой основе и водно-масляные
эмульсии могут быть разбавлены до 1 % в растворе изопропилмиристата, как описано
выше, при необходимости, нагреванием до температуры не превышающей 40 °С. В
исключительных случаях может оказаться необходимым нагревание до температуры 44
°С. Фильтруют насколько возможно быстро и продолжают испытание в соответствии с
указаниями, приведенными выше для масел и маслянных растворов.
Метод прямого посева.
Количество испытуемого образца, приведенное в Таблице 2.6.1.−2.. помещают
непосредственно в питательную среду, так что бы объем продукта составлял не более 10 %
от объема среды, при отсуствии других указаний в частной монографии. Если испытуемый
образец обладает антимикробной активностью, испытания выполняют после нейтрализации
соответствующим нейтрализующим агентом или путем разбавления в достаточном
количестве питательной средой. При необходимости использования большого объема
продукта предпочтительнее использовать концентрированную питательную среду,
приготовленную с учетом последующего разведения.
Масляные жидкости. Используют питательные среды с добавкой подходящего эмульгатора
в концентрации, установленной в ходе проверки пригодности методики испытания,
например, полисорбата 80 с концентрацией 10 г/л.
Мази и кремы. Готовят разведение испытуемого образца в соотношении 1:10, путем
эмульгирования с использованием выбранного эмульгатора в соответствующем
стерильном растворителе, например, растворе мясного или казеинового пептона с
концентрацией 1 г/л. Разведенный испытуемый образец переносят в среду, не
содержащую эмульгатора. Инокулированную среду инкубируют не менее 14 сут.
Состояние культуры наблюдает несколько раз за весь период инукубирования.
Питательные среды, на которые были посеяны масляные продукты, ежедневно осторожно
встряхивают. При использовании жидкой тиогликолевой среды для определения
анаэробных микроорганизмов, встряхивание или перемешивание сводят к минимуму для
поддержания анаэробных условий.
Кетгут и другие шовные материалы для ветеринарии. Для каждой среды используют
количество продукта, не менее указанного в таблице 2.6.2.2. Герметичную упаковку с
шовным материалом вскрывают в асептических условиях, для каждой питательно среды
используют по три участка нити.
УЧЕТ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИСПЫТАНИЯ
8
Во время инкубации периодически просматривают посевы. Наличие роста микроорганизмов
определяют визуально. Если испытуемый образец вызывает помутнение питательной среды
и визуально нельзя определить наличие или отсутствие микробного роста, через 14 сут после
начала испытания переносят порции помутневшей среды (каждая порция не менее 1 мл) в
емкости с аналогичной свежей стерильной средой. Инкубируют исходные и повторные
посевы не 4 сут. Рост микроорганизмов определяют визуально по наличию мутности, осадка,
хлопьев и других изменений питательной среды и подтверждают микроскопическим
исследованием.
При отсутствии роста микроорганизмов, считают, что испытуемый образец соответствует
требованиям испытания на стерильность. При обнаружении роста микроорганизмов,
считают, что испытуемый образец не соответствует требованиям испытания на стерильность,
если не может быть доказано, что результаты испытания не являются достоверными по
причинам, не связанным с испытуемым образцом. Результаты испытания на стерильность
могут быть признаны недостоверными в случае выполнения одного или несколько условий,
перечисленных ниже:
а) данные микробиологического контроля помещений, где проводятся испытания на
стерильность, указывают на несоответствие помещения установленным требованиям.
Например, получены неудовлетворительные результаты микробиологического контроля
окружающей среды (воздушной среды, поверхностей и рук персонала и др.) при проведении
испытания на стерильность;
b) проверка методики, используемой в данном испытании, показала наличие ошибки;
c) обнаружен рост микроорганизмов в отрицательном контроле (контроль стерильного
растворителя или питательной среды);
d) после идентификации микроорганизмов, выделенных в ходе испытания, рост
определенного вида или видов микроорганизмов может считаться ошибкой, связанной с
материалами и/или методикой, использованной при проведении испытания на стерильность
Если результаты испытания признаны недостоверными, испытание повторяют, используя то
же количество образцов, что и в первоначальном испытании.
Если в результате повторного испытания не обнаруживают рост микроорганизмов, считают,
что исследуемый образец соответствует требованиям испытания на стерильность. Если в
результате повторного испытания обнаруживают рост микроорганизмов, считают, что
исследуемый образец не соответствует требованиям испытания на стерильность.
РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ИСПЫТАНИЯ К ПАРЕНТЕРАЛЬНЫМ,
ОФТАЛЬМОЛОГИЧЕСКИМ И ДРУГИМ НЕИНЪЕКЦИОННЫМ ЛЕКАРСТВЕННЫМ
СРЕДСТВАМ, КОТОРЫЕ ДОЛЖНЫ СООТВЕТСТВОВАТЬ ТРЕБОВАНИЯМ НА
СТЕРИЛЬНОСТЬ
При проведении испытания методом мембранной фильтрации используют, по возможности,
все содержимое емкости, но не менее количества, указанных в таблице 2.6.1.2, при
необходимости разбавляя его примерно до 100 мл подходящим стерильным раствором,
например, нейтральным раствором мясного или казеинового пептона с концентрацией 1 г/л.
При проведении испытания методом прямого посева сред используют количества, указанные
в таблице 2.6.1.2, при отсутствии другого обоснования или разрешения уполномоченного
органа. Испытания на стерильность в отношении бактерий и грибов выполняют на одном и
9
том же испытуемом образце. В случаях, если объем или количество, содержащиеся в одной
емкости, являются недостаточными для проведения испытаний, для посева на различные
среды используют содержимое двух или более емкостей.
МИНИМАЛЬНОЕ КОЛИЧЕСТВО ИСПЫТУЕМЫХ ЕДИНИЦ
Минимальное количество единиц, подлежащих испытанию, в зависимости от размера партии
указано в таблице. 2.6.1.3.
Таблица 2.6.1.3. Минимальное количество испытуемых единиц
Количество единиц (ампул, флаконов и
др.) в партии *
Минимальное количество испытуемых
единиц (ампул, флаконов и др.) для каждой
питательной среды **
Парентеральные лекарственные средства
Не менее 100
10 % или 4 единицы, в зависимости от того,
какое количество является наибольшим
Более 100, но не более 500
10 емкостей
Не менее 500
2 % или 20 единиц (10 единиц для
парентеральных лекарственных средств
больших объемов), в зависимости от того,
какое из этих количеств является наименьшим
Офтальмологические и другие неинъекционные лекарственные средства
Не более 200
5 % или 2 единицы, в зависимости от того,
какое из этих количеств является наименьшим
Более 200
10 единиц
Если лекарственное средство представлено
в однодозовой упаковке, то применяют
схему для парентеральных препаратов
Кетгут и другие шовные материалы для
ветеринарного применения
2 % или 5 единиц, в зависимости от того, что
какое из этих количеств является наибольшим,
но не более 20 единиц
Готовые нерасфасованные продукты (in balk), в твердой лекарственной форме
Не более 4 упаковок
Каждую единицу
более 4 упаковок, но не более 50 упаковок
20 % или 4 единицы, в зависимости от того,
что какое из этих количеств является
наибольшим
Свыше 4, но не более 50
Свыше 50
2 % или 10 в зависимости от того, что какое из
этих количеств является наибольшим
* Если количество единиц в партии неизвестно, используют максимальное количество,
указанное в колонке.
** При отсутствии другого обоснования или разрешения уполномоченного органа
Руководство по проведению испытания на стерильность приведены в общей монографии
5.1.9.