3/1:20610

2.6.10. ИСПЫТАНИЕ НА ГИСТАМИН

Настоящая общая монография распространяется на определение содержания

гистамина in vitro в лекарственных средствах для парентерального применения.

ПОДГОТОВКА ИЗОЛИРОВАННОГО ОРГАНА

Для испытания берут морскую свинку массой тела от 250 г до 350 г. За 24 ч до испытания

животное не кормят, но оставляют свободный доступ к воде. После эвтаназии у морской

свинки вскрывают брюшную полость от лонного сочленения до грудины и находят

слепую кишку. Место еѐ перехода в ободочную кишку является ориентиром при поиске

подвздошной кишки, которая отходит от слепой кишки за 1 – 2 см до этого участка. Для

того чтобы извлечь подвздошную кишку, тупым зажимом или пинцетом плотно

захватывают еѐ основание и отрезают ножницами. Отсечѐнный конец кишки слегка

приподнимают, а затем без натяжения и, не перехватывая еѐ, отсекают ткань брыжейки

маленькими разрезами при помощи тупоконечных ножниц. Остатки брыжейки удалять не

следует. Все манипуляции с подвздошной кишкой следует проводить осторожно, не

растягивая еѐ. Для испытания пригоден дистальный участок подвздошной кишки,

исключая 10 – 15 см, ближайшие к слепой кишке. Подвздошную кишку нарезают на

равные части (около 6 см каждая) и помещают в чашку Петри с гипокальциевым

раствором Тироде (примечание 1). Данным раствором осторожно промывают полученные

отрезки с помощью шприца или резиновой груши с пастеровской пипеткой с затуплѐнным

концом до полного удаления содержимого кишечника. Промытые отрезки подвздошной

кишки помещают в чистый гипокальциевый раствор Тироде. Они могут быть

использованы сразу или храниться в течение 24 ч при температуре от 2 °С до 4 °С

(примечание 2). Непосредственно перед испытанием промытый отрезок кишки разрезают

до длины, требуемой условиями испытания (10 мм при использовании электронного

датчика или 20 мм при использовании механического рычага и кимографа).

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ СРАВНЕНИЯ И РАЗВЕДЕНИЙ ИСПЫТУЕМОГО

ОБРАЗЦА

Растворы сравнения. В качестве растворов сравнения используют растворы гистамина

дигидрохлорида Р в трѐх концентрациях: раствор 1 (1.30 г/мл – 10 г/мл – 6 г/мл); раствор 2

(2.5 × 10

-6

г/мл) и раствор 3 (5.00 × 10

-6

г/мл), вызывающие 50 %, 75 % и 100 %

сокращение кишки соответственно. В качестве растворителя используют 0.9 % раствор

натрия хлорида. Объѐм введения растворов сравнения составляет 1/100 от объѐма

ванночки.

Разведение испытуемого образца. Испытанию подвергают неразведѐнный испытуемый

образец, когда максимально допустимая нормативным документом по качеству

концентрация гистамина в неразведѐнном препарате находится в диапазоне от 1.30 × 10

-6

г/мл до 2.50 × 10

-6

г/мл в пересчѐте на гистамина дигидрохлорид Р. Объѐм введения

испытуемого образца должен составлять 1/100 от объѐма ванночки. Если значение

максимально допустимой концентрации гистамина в пересчѐте на гистамина

дигидрохлорид Р в неразведѐнном испытуемом образце, меньше указанного диапазона или

близко к его нижнему пределу, допустимо увеличение объѐма введения неразведѐнного

испытуемого образца до 1/20 от объѐма ванночки. Если максимально допустимая

концентрация гистамина в пересчѐте на гистамина дигидрохлорид Р в неразведѐнном

испытуемом образце находится выше указанного диапазона, испытуемый образец

разводят 0.9 % раствором натрия хлорида до предполагаемой концентрации гистамина

дигидрохлорида 2.50 × 10

-6

г/мл (объѐм введения 1/100 от объѐма ванночки).

РЕГИСТРИРУЮЩАЯ СИСТЕМА

Для регистрации сокращений изолированного отрезка подвздошной кишки морской

свинки в изотонических условиях в ответ на введение растворов сравнения и

испытуемого образца используют регистрирующую систему, состоящую из

термостатируемой ванночки с гипокальциевым раствором Тироде при температуре от 34

°С до 36 °С, а также электронного датчика с регистрирующим устройством или

механического рычага с кимографом. Ванночку аэрируют карбогеном (95 % О

и 5 % СО

)

или воздухом. Нагрузка обычно составляет от 500 мг до 800 мг. В случае использования

механического рычага для вычисления нагрузки следует применять правило равновесия:

сила × плечо силы = нагрузка × плечо нагрузки.

ИСПЫТАНИЕ

Изолированный отрезок подвздошной кишки помещают в ванночку и прикрепляют к

регистрирующей системе с помощью лигатуры по диагонали за противоположные концы:

один — к крючку на дне ванночки, а другой — к датчику или рычагу. Прикладывают к

отрезку нагрузку и оставляют его в покое на 30 мин. За это время необходимо не менее 3

раз сменить в ванночке гипокальциевый раствор Тироде.

Адаптация изолированного отрезка подвздошной кишки морской свинки к

субмаксимальной дозе гистамина

В термостатируемую ванночку вводят раствор 3 в объѐме, равном 1/100 от еѐ ѐмкости.

Через 30 с (время экспозиции) ванночку промывают тройным объѐмом гипокальциевого

раствора Тироде. После первого отмывания проводят второе таким же объѐмом раствора.

Не менее чем через 4 мин после первого введения снова повторяют цикл «введение –

экспозиция - два отмывания». Эти циклы повторяют до тех пор, пока не получат не менее

двух одинаковых пиков. Их высоту принимают за 100 % (примечание 3). Временные

интервалы между введениями испытуемого вещества и между двумя отмываниями

должны быть постоянными.

Испытание испытуемого образца на гистамин

Предварительное испытание

После достижения постоянной величины ответа отрезка кишки на введение раствора 3

проводят испытание испытуемого образца на гистамин. Для этого с интервалом не менее 4

мин однократно в случайном порядке вводят растворы 1 и 3, и неразведенный

испытуемый образец. Циклы «введение - экспозиция – два отмывания» такие же, как и

при проведении адаптации органа к субмаксимальной дозе. В случае, если пик,

полученный в ответ на введение испытуемого образца, по высоте не меньше, чем пик

раствора 1, проводят количественное определение содержания гистамина в испытуемом

образце (см. п. 2.1). Если пик, полученный в ответ на введение испытуемого образца,

меньше пика раствора 1 или вообще отсутствует, проводят контрольное испытание (см. п.

2.2).

Количественное испытание испытуемого образца на гистамин

В случайном порядке поочерѐдно вводят растворы 1 и 3 (1/100 от объѐма ванночки), и

разведѐнный или неразведѐнный испытуемый образец (тот же объѐм введения, что и при

предварительном испытании) до получения не менее трѐх пиков в ответ на введение

каждого раствора.

Находят среднее значение ответа отрезка кишки на каждый раствор. С помощью

регрессионного анализа вычисляют параметры линейной зависимости среднего ответа

кишки на введение растворов сравнения от логарифма их концентрации. Затем,

подставляя полученные значения этих параметров в уравнение регрессии, вычисляют

концентрацию гистамина в том разведении испытуемого образца, которому соответствует

средняя высота его пика, и исходя из этого, рассчитывают содержание гистамина в

неразведѐнном испытуемом образце.

Испытуемый образец считают прошедшим испытание, если найденное содержание

гистамина не превышает максимально допустимое, указанное в нормативном документе

по качеству (коэффициент пересчѐта гистамина дигидрохлорида на гистамин-основание

равен 0.6038).

Контрольное испытание

Схема проведения контрольного испытания такая же, как и при количественном

определении содержания гистамина в испытуемом образце, только вместо испытуемого

образца используют раствор 2 (1/100 от объѐма ванночки). Если средняя высота его пика

соответствует вводимой концентрации гистамина дигидрохлорида в данном растворе

(2.50 × 10

-6

г/мл), то результаты опыта следует признать удовлетворительными.

Результаты опыта следует признать неудовлетворительными в каждом из следующих

случаев:

 если средняя высота пика раствора 2 не соответствует вводимой концентрации

гистамина дигидрохлорида в данном растворе (2.50 × 10

-6

г/мл);

 если при количественном определении содержания гистамина в испытуемом образце

отсутствует воспроизводимость ответов отрезка кишки на введение испытуемого

образца;

 если в процессе эксперимента наблюдается значительное снижение высоты пиков.

В каждом из этих 3 случаев следует провести испытание испытуемого образца на

вещества депрессорного действия в соответствии с общей монографией Испытание на

депрессорные вещества.

Примечания:

Гипокальциевый раствор Тироде.

Состав:

− натрия хлорид 80.00 г

− натрия гидрокарбонат 10.00 г

− D -глюкоза 11.00 г

− калия хлорид 2.00 г

− кальция хлорид дигидрат 1.30 г

− магния хлорид гексагидрат 2.10 г

− натрия дигидрофосфат моногидрат 0.58 г

− вода очищенная до 10 л

В мерном цилиндре вместимостью 1 л растворяют в воде очищенной Р навески натрия

хлорида Р, натрия гидрокарбоната Р и D-глюкозы Р в любом порядке. Доводят объѐм

раствора тем же растворителем до метки, перемешивают и переливают содержимое

цилиндра в десятилитровую стеклянную емкость с притѐртой пробкой или

полиэтиленовый сосуд того же объема с завинчивающейся крышкой. Таким же образом,

но по отдельности, каждую из оставшихся навесок растворяют в 1 л воды очищенной Р и

по очереди переносят в тот же десятилитровый сосуд, строго придерживаясь следующего

порядка:

1) калия хлорид Р

2) кальция хлорид Р

3) магния хлорид Р

4) натрия дигидрофосфат Р.

Затем добавляют воду очищенную Р до отметки 10 л и вновь тщательно перемешивают.

Полученный раствор хранят при температуре от 3 °С до 5 °С не более 24 ч. Помутнение

раствора недопустимо. Помутневший раствор следует вылить, тщательно промыть сосуд в

проточной воде и прополоскать водой очищенной. Поверхностно активные моющие

средства применять нельзя. В качестве дополнительной меры по предупреждению

спонтанной активности изолированного органа, в состав раствора можно добавить

атропина сульфат в концентрации 0.5 мг/л.

Сосуд, в котором находятся отрезки подвздошной кишки при хранении, плотно не

закрывают, а затягивают двойным слоем марли, чтобы обеспечить доступ воздуха. Перед

использованием в опыте отрезки следует подготовить.

Для этого сосуд в течение 10 мин держат при комнатной температуре, а затем в течение 20

мин при температуре от 34 °С до 36 °С в термостате. После нагревания из отрезка следует

удалить слизь. Это достигается лѐгкими поглаживающими движениями в продольном

направлении.

Струя вводимого раствора должна быть направлена не прямо на изолированный отрезок

кишки, а в сторону стенки ванночки, причѐм направление струи не должно меняться.

Скорость введения должна быть максимально высокой и постоянной. Регистрацию

сокращений проводят непрерывно (скорость ленты 2 мм/мин). В случае использования

механического рычага и кимографа во время отмывания можно прекращать запись.