3/1 :20612

2.6.12. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИСПЫТАНИЕ НЕСТЕРИЛЬНЫХ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ: ОБЩЕЕ КОЛИЧЕСТВО ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ

АЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

ВВЕДЕНИЕ

Иcпытания, описанные ниже, позволяют проводить количественный подсчет мезофильных

бактерий и грибов, способных расти в аэробных условиях. Испытания предназначены в

основном для того, чтобы определить соответствует ли испытуемый образец требованиям,

установленным к микробиологической чистоте. Если испытания проводят с этой целью,

следуют инструкциям, приведенным ниже, включая количество испытуемых образцов,

отбираемых для анализа и интерпретацию полученных результатов.

Приведенные ниже методы не применимы к испытуемым образцам, содержащим

жизнеспособные микроорганизмы в качестве активных ингредиентов.

Могут использоваться альтернативные микробиологические методы, включая

автоматизированные методы, если доказана их эквивалентность фармакопейному методу.

ОБЩИЕ ПРОЦЕДУРЫ

Испытания выполняют в условиях, позволяющих предупредить контаминацию испытуемого

образца в ходе испытания. Меры предосторожности, предпринимаемые для предотвращения

контаминации, не должны влиять на микроорганизмы, обнаруживаемые в ходе испытания.

Если испытуемый образец обладает антимикробной активностью, она должна быть удалена

или нейтрализована, насколько это возможно. В случае использования для этой цели

инактиваторов, должна быть доказана их эффективность и отсутствие токсичности в

отношении микроорганизмов.

Если для подготовки испытуемого образца используют поверхностно-активные вещества,

должно быть доказано отсутствие их токсичности в отношении микроорганизмов и

совместимость с используемыми инактиваторами.

МЕТОДЫ ПОДСЧЕТА

Используют метод мембранной фильтрации или чашечный метод подсчета в установленном

порядке. Метод наиболее вероятного числа, как правило, является наименее точным методом

микробиологического подсчета, однако для определенных групп испытуемых образцов с

очень низкой бионагрузкой данный метод может быть наиболее приемлемым.

Выбор метода основывается на таких факторах, как природа испытуемого образца и

нормируемый предел содержания микроорганизмов. Выбранный метод должен обеспечивать

проведение испытания образца достаточного размера для оценки соответствия

спецификации. Должна быть установлена пригодность выбранного метода.

ПРОВЕРКА РОСТОВЫХ СВОЙСТВ, ПРИГОДНОСТЬ МЕТОДА ПОДСЧЕТА И

ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Должна быть установлена способность проводимого испытания обнаруживать

микроорганизмы в присутствии испытуемого образца. При внесении каких-либо изменений в

методику или испытуемые образцы, которые могут повлиять на результат испытания,

требуется подтверждение пригодности методики испытания.

ТЕСТ-ШТАММЫ

Используют стандартизированные стабильные суспензии тест-штаммов микроорганизмов

(система посевных материалов) или готовят их, как указано ниже. Допускается не более 5

пассажей от исходного посевного материала.

Каждый тест-штамм бактерий и грибов выращивают отдельно, как описано в таблице

2.6.12.−1.

Таблица 2.6.12.-1. – Приготовление и использование тест-микроорганизмов

Микроорга

низм

Приготовлен

ие тест–

штамма

Стимуляция роста

Пригодность метода подсчета

присутствии продукта

Общее

число

аэробных

микробов

Общее

число

дрожжей и

грибов

Общее

число

аэробных

микробов

Общее

число

дрожжей и

грибов

Staphylococc

us aureus,

такие как:

АТСС 6538

NCIMB 9518

СИП 4.83

NBRC 13276

Соево –

казеиновый

агар или

соево –

казеиновая

среда

(30 – 35) °С

(18 – 24) ч

Соево –

казеиновая

среда и

соево –

казеиновый

бульон

≤ 100 КОЕ

(30 – 35) °С

≤ 3 дней

–

Соево –

казеиновый

агар с

гидролизатом/Н

ВЧ

соево –

казеиновый

бульон с

гидролизатом

≤ 100 КОЕ

(30 – 35) °С

≤ 3 дней

–

Pseudomonas

aeruginosa,

такие как:

АТСС 9027

NCIMB 8626

СИП 82.118

NBRC 13275

Соево –

казеиновый

агар или

соево –

казеиновый

бульон

(30 – 35) °С

(18 – 24) ч

Соево –

казеиновый

бульон и

соево –

казеиновый

бульон

≤ 100 КОЕ

(30 – 35) °С

≤ 3 дней

–

Соево -

казеиновый

агар с

гидролизатом/Н

ВЧ

соево –

казеиновый

бульон с

гидролизатом

≤ 100 КОЕ

(30 – 35) °С

≤ 3 дней

–

Bacillus

subtilis,

такие как:

АТСС 6633

NCIMB 8054

СИП 52.62

NBRC 3134

Соево –

казеиновый

агар или

соево –

казеиновый

бульон

(30 – 35) °С

(18 – 24) ч

Соево –

казеиновый

бульон и

соево –

казеиновый

бульон

≤ 100 КОЕ

(30 – 35) °С

≤ 3 дней

–

Соево –

казеиновый

агар с

гидролизатом/Н

ВЧ

соево –

казеиновый

бульон с

гидролизатом

≤ 100 КОЕ

(30 – 35) °С

≤ 3 дней

–

Candida

albicans

такие как:

АТСС 10231

НЦПФ 3179

ИП 48.72

НБРК 1594

Сабуро–

декстрозный

агар или

бульон

Сабуро–

декстрозный

(20 – 25) °C

2 – 3 дня

Соево–

казеиновый

агар

≤ 100 КОЕ

(30 – 35) °С

≤ 5 дней

Сабуро–

декстрозн

ый агар

≤ 100 КОЕ

(20 – 25)

°С

≤ 5 дней

Соево–

казеиновый агар

≤ 100 КОЕ

(30 – 35) °С

≤ 5 дней

НВЧ: не

применимо

Сабуро–

декстрозны

й агар

≤ 100 КОЕ

(20 – 25) °С

≤ 5 дней

Aspergillus

brasiliensis

например:

АТСС 16404

ИМИ

149007

ИП 1431.83

NBRC 9455

Сабуро–

декстрозный

агар

или

картофельно-

декстрозный

агар

(20 – 25) °С

5 – 7 дней или

до

достижения

хорошего

спорообразов

ания

Соево–

казеиновый

агар

≤ 100 КОЕ

(30 – 35) °С

≤ 5 дней

Сабуро–

декстрозн

ый агар

≤ 100 КОЕ

(20 – 25)

°С

≤ 5 дней

Соево–

казеиновый агар

≤ 100 КОЕ

(30 – 35) °С

≤ 5 дней

НВЧ: не

применимо

Сабуро–

декстрозны

й агар

≤ 100 КОЕ

(20 – 25) °С

≤ 5 дней

Для приготовления суспензий тест-штаммов используют раствор натрия хлорида с пептоном

с pH 7.0 или фосфатный буферный раствор с pH 7.2; при суспендировании спор A. brasiliensis

в буфер можно добавить 0.05 % раствор полисорбата 80. Суспензии используют в течение 2 ч

или в течение 24 ч при условии хранения при температуре от 2 °C до 8 °C. В качестве

альтернативы для приготовления и последующего разведения свежеприготовленной

суспензии вегетативных клеток A. brasiliensis или B. Subtilis готовят суспензию стабильных

(жизнеустойчивых) спор, а затем для посева используют подходящий объем суспензии спор.

Суспензия стабильных спор может храниться при температуре от 2 °C до 8 °C в течение

установленного срока хранения.

ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ

Для проверки условий испытания проводят отрицательный контроль с использованием

подходящего растворителя вместо испытуемого образца. Не должно быть роста

микроорганизмов. Отрицательный контроль также проводится при тестировании

испытуемого образца, как описано в разделе 5. При неудачном отрицательном контроле

требуется расследование.

ПРОВЕРКА РОСТОВЫХ СВОЙСТВ

Испытанию подлежит каждая серия готовой к использованию коммерческой питательной

среды, а также каждая серия среды, приготовленной или сухой среды, или из описанных

компонентов. Инокулируют емкости/чашки с соево-казеиновой средой и соево-казеиновым

агаром небольшим количеством (не более 100 КОЕ) микроорганизмов, указанных в таблице

2.6.12. −1 используя отдельную емкость/чашки со средой для каждого вида. Инокулируют

чашки с агаром Сабуро с декстрозой небольшим количеством (не более 100 КОЕ)

микроорганизмов, указанных в таблице 2.6.12. −1, используя отдельные чашки со средой для

каждого вида. Инкубирование проводят в условиях, указанных в таблице 2.6.12. −1.

Для твердых сред полученное количество выросших микроорганизмов не должно отличаться

более чем в 2 раза от теоретического значения для стандартизированного инокулята. Для

свежеприготовленного инокулята должен наблюдаться рост микроорганизмов сопоставимый

с ранее полученными результатами на ранее испытанной и утвержденной к использованию

серии среды. Жидкая среда пригодна к использованию, если наблюдается отчетливо видимый

рост микроорганизмов, сопоставимый с ранее полученными результатами на ранее

испытанной и утвержденной к использованию серии питательной среды.

ПРИГОДНОСТЬ МЕТОДА ПОДСЧЁТА В ПРИСУТСТВИИ ИСПЫТУЕМОГО ОБРАЗЦА

Подготовка испытуемого образца. Метод пробоподготовки зависит от физических свойств

испытуемого образца. Если невозможно подтвердить пригодность ни одной из методик,

описанных ниже, может быть разработана альтернативная методика.

Водорастворимые лекарственные средства. Растворяют или разбавляют (обычно готовят

разведение 1:10) испытуемый образец в забуферном растворе натрия хлорида с пептоном с

pH 7.0, фосфатном буферном растворе с pH 7.2 или соево–казеиновой средой с гидролизатом.

При необходимости доводят значение рН до 6–8. Дальнейшие разведения, при

необходимости, готовят с тем же растворителем.

Нерастворимые в воде лекарственные средства, не содержащие жира. Испытуемый

образец суспендируют (обычно готовят разведение 1:10) в забуферном растворе натрия

хлорида с пептоном с pH 7.0, фосфатном буферном растворе с pH 7.2 или соево–казеиновой

средой с гидролизатом. В случае плохо смачиваемых веществ допускается добавление

поверхностно-активного вещества, например, раствор полисорбата 80 в концентрации 1 г/л.

При необходимости доводят значение рН до 6–8. Дальнейшие разведения, при

необходимости, осуществляют тем же разбавителем.

Лекарственные средства, содержащие жиры. Испытуемый образец растворяют в

изопропилмиристате, стерилизованном методом фильтрации или смешивают с минимально

необходимым количеством стерильного полисорбата 80 или другого нейтрального

стерильного поверхностно-активного вещества, при необходимости, нагревая до

температуры не более 40 °С или в исключительных случаях до температуры не более 45 °С.

Осторожно перемешивают и при необходимости поддерживают температуру на водяной

бане. Прибавляют предварительно нагретый выбранный разбавитель до получения

разведения исходного образца 1:10. Тщательно перемешивают, поддерживая температуру в

течение минимального времени, необходимого для образования эмульсии. Дальнейшие

серийные десятикратные разведения могут быть приготовлены с использованием выбранного

разбавителя, содержащего подходящую концентрацию стерильного полисорбата 80 или

другого нейтрального стерильного поверхностно-активного вещества.

Жидкости или твердые вещества в форме аэрозоля. Испытуемый образец в асептических

условиях переносят в аппарат для мембранной фильтрации или стерильный контейнер для

дальнейшего отбора образцов. Используют либо все содержимое, либо определенное

количество отмеренных доз из каждого контейнера.

Трансдермальные пластыри. С пластырей удаляют защитное покрытие («предохраняющие

полоски») и помещают в стерильные стеклянные или пластиковые лотки клейкой

поверхностью вверх. Клейкую поверхностью накрывают стерильным пористым материалом,

например стерильной марлей, для предотвращения слипания пластырей друг с другом, и

переносят их в подходящий объем выбранного разбавителя, содержащего инактиваторы,

например, полисорбат 80 и/или лецитин. Энергично встряхивают не менее 30 мин.

Ородиспергируемые пленки. 10 испытуемых образцов пленок растворяют в забуферном

растворе натрия хлорида с пептоном с pH 7.0, фосфатном буферном растворе с pH 7.2 или

соево-казеиновой среде с гидролизатом. Для достижения растворения, при необходимости

нагревают испытуемый образец до температуры не выше 40 °С или, в исключительных

случаях до температуры не выше 45 °С, при встряхивании или без него. При необходимости

доводят значение рН до 6–8. Дальнейшие разведения, при необходимости, готовят с тем же

разбавителем.

Посев и разведение. В испытуемый образец, приготовленный, как описано выше (раздел

«Подготовка испытуемого образца»), и в контрольный образец (без испытуемого материала)

прибавляют достаточный объем микробной суспензии для получения инокулята,

содержащего не более 100 КОЕ. Объем суспензии инокулята не должен превышать 1 % от

объема разбавленного испытуемого образца.

Для подтверждения приемлемого восстановления микроорганизмов из испытуемого образца,

в испытании должен использоваться наименьший возможный фактор разбавления

приготовленного образца. В случае, когда это невозможно из-за антимикробной активности

или плохой растворимости, должны быть разработаны соответствующие протоколы

исследования. Если ингибирование роста микроорганизмов испытуемым образцом

невозможно избежать, аликвота микробной суспензии может быть добавлена после

нейтрализации, разведения или фильтрации.

Нейтрализация/устранение антимикробной активности. Число микроорганизмов,

восстановленных из приготовленного испытуемого образца, разведенного, как описано в

разделе «Посев и разведение», и инкубированного в соответствии с методикой, описанной в

разделе «Восстановление микроорганизмов в присутствии испытуемого лекарственного

средства», сравнивается с числом микроорганизмов, восстановленных из контрольного

образца.

Если рост микроорганизмов ингибируется (уменьшение более чем в 2 раза), то в данную

методику вносят соответствующие изменения, чтобы обеспечить достоверность получаемых

результатов. Изменения методики могут включать, например, (1) увеличение объема

разбавителя или питательной среды, (2) введение в состав разбавителя специфических или

общих нейтрализующих агентов, (3) мембранная фильтрация или (4) сочетание

вышеописанных мер.

Нейтрализующие агенты. Для нейтрализации активности антимикробных агентов могут

быть использованы нейтрализующие агенты (таблица 2.6.12.–2). Они могут быть добавлены к

выбранному разбавителю или внесены в питательную среду, предпочтительно, перед

стерилизацией. Если они используются, их эффективность и отсутствие токсичности для

микроорганизмов должны быть доказаны путем проведения контрольного испытания с

нейтрализующим агентом и в отсутствии испытуемого образца.

Если не удается найти подходящий метод нейтрализации, может быть предположено, что

выделение микроорганизмов не достигается вследствие бактерицидного действия

испытуемого образца. Эти данные свидетельствуют о низкой вероятности контаминации

лекарственного средства определенными видами микроорганизмов. Однако, возможно, что

испытуемый образец ингибирует только рост некоторых из описанных в настоящем разделе

микроорганизмов, и не обладает антимикробным действием в отношении других видов, не

входящих в указанные тест-штаммы микроорганизмов или для которых последние не

репрезентативны. В этом случае испытание проводят с использованием наиболее высокого

фактора разведения, соответствующего росту микроорганизмов и специфическим критериям

приемлемости.

Таблица 2.6.12.–2. – Общие нейтрализующие агенты для веществ с антимикробным

действием

Вещества с антимикробным действием

Возможный метод нейтрализации

Глутаровый альдегид, ртутные соединения

Натрия гидросульфит

Фенолы, спирт, альдегиды, сорбат

Разведение

Альдегиды

Глицин

Четвертичные аммониевые соединения,

парагидроксибензоаты (парабены), бис-

бигуаниды

Лецитин

Четвертичные аммониевые соединения, йод,

парабены

Полисорбат

Ртутьсодержащие соединения

Тиогликолят

Ртуть, галогены, альдегиды

Тиосульфат

Соли этилендиаминтетраацетата

или Са

ионы

Восстановление микроорганизмов в присутствии испытуемого лекарственного

средства. Для каждого из перечисленных микроорганизмов проводят отдельные испытания.

Считают только микроорганизмы добавленного тест-штамма.

Метод мембранной фильтрации. Используют мембранные фильтры с номинальным

размером пор не более 0.45 мкм. Тип фильтрующего материала выбирают таким образом,

чтобы на эффективность удерживания бактерий не влияли компоненты испытуемого образца.

Для каждого из перечисленных микроорганизмов используется один мембранный фильтр.

Подходящее количество испытуемого образца, приготовленного, как описано в разделах

«Подготовка испытуемого образца», «Посев и разведение» и «Нейтрализация/устранение

антимикробной активности» (предпочтительно, соответствующее 1 г испытуемого

лекарственного средства или меньшее его количество, если ожидается большое содержание

КОЕ), переносят на мембранный фильтр, немедленно фильтруют и промывают его

соответствующим объемом растворителя. Для определения общего числа аэробных микробов

(TAMC) переносят мембранный фильтр на поверхность соево-казеинового агара. Для

определения общего комбинированного количества дрожжей/плесени (TYMC) переносят

мембрану на поверхность Сабуро-декстрозного агара. Инкубируют чашки, как указано в

таблице 2.6.12.-1. Проводят подсчет.

Методы подсчета на чашках. Методы подсчета на чашках для каждой среды выполняют не

менее двух повторов и используют среднее значение результата.

Метод глубинного посева

В чашки Петри диаметром 9 см прибавляют по 1 мл испытуемого образца, приготовленного,

как описано в разделах «Подготовка испытуемого образца», «Посев и разведение» и

«Нейтрализация/устранение антимикробной активности», и 15–20 мл соево–казеиного агара

или Сабуро–декстрозного агара, температура обеих сред должна быть не более 45 °С. Если

используют чашки Петри большего размера, количество агаровой среды соответственно

увеличивают. Для каждого из микроорганизмов, перечисленных в таблице 2.6.12.–1,

используют не менее двух чашек Петри. Инкубируют чашки, как указано в таблице 2.6.12.–1.

Вычисляют среднее арифметическое значение число колоний в среде и рассчитывают число

КОЕ в исходном посевном материале.

Метод поверхностного посева

В чашки Петри диаметром 9 см прибавляют по 15-20 мл соево –казеинового агара или

Сабуро–декстрозного агара, температура обеих сред должна быть не более 45 °С. Средам

дают затвердеть. При использовании чашек Петри большего размера объем агара

соответственно увеличивают. Чашки сушат, например, в шкафу с ламинарным потоком

воздуха или термостате. Для каждого из микроорганизмов, перечисленных в таблице 2.6.12. –

1, используют не менее двух чашек Петри. Распределяют отмеренный объем не менее 0.1 мл

испытуемого образца, приготовленного, как описано в разделах «Подготовка испытуемого

образца», «Посев и разведение» и «Нейтрализация/устранение антимикробной активности»,

по поверхности среды. Инкубируют и подсчитывают, как указано в разделе «Метод

глубинного посева».

Метод наиболее вероятного числа. Точность и правильность метода наиболее вероятного

числа меньше, чем у метода мембранной фильтрации или метода чашечного подсчета. В

частности, результаты при подсчете плесневелых грибов являются недостоверными. По этим

причинам метод наиболее вероятного числа применяют лишь для подсчета TAMC в случае,

когда другие методы недоступны. Если использование данного метода обосновано,

поступают следующим образом.

Подготавливают серию из не менее трех последовательных десятикратных разведений

испытуемого лекарственного средства, как описано в разделах «Подготовка испытуемого

образца», «Посев и разведение» и «Нейтрализация/устранение антимикробной активности»,.

От каждого разведения отбирают три пробы по 1 г или 1 мл, которые вносят в три пробирки с

9 – 10 мл соево–казеиновой среды с гидролизатом. При необходимости в питательную среду

могут быть добавлены поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат 80, или

инактиватор противомикробных средств. Таким образом, для трех разведений инокулируют

девять пробирок. Все пробирки инкубируют при температуре (30 – 35) °C в течение 3 сут. В

том случае, если свойства испытуемого лекарственного средства приводят к получению

неопределенных или трудно регистрируемых результатов, производят пересев на тот же

бульон или на соево-казеиновый агар при той же температуре в течение 1 – 2 сут и для

подсчета используют полученные результаты. Определяют наиболее вероятное количество

микроорганизмов в грамме или миллилитре испытуемого лекарственного средства по

таблице 2.6.12. –3.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

При проверке пригодности метода мембранной фильтрации или метода подсчета на чашках

должно быть получено среднее количество любого тест - микроорганизма, не отличающееся

более чем в 2 раза от значения контрольного образца, определенного в разделе «Посев и

разведение», в отсутствии испытуемого лекарственного средства. При проверке пригодности

метода наиболее вероятного числа расчетное значение числа колоний должно быть в

пределах 95 % доверительного интервала от результатов, полученных при испытании с

контрольным образцом.

Если вышеуказанные критерии не могут быть соблюдены для одного или более тестируемых

микроорганизмов, любым из описанных методов, для испытуемого лекарственного средства

используют метод и условия испытания, наиболее близкие к требованиям.

ИСПЫТАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

КОЛИЧЕСТВО, ИСПОЛЬЗОВАННОЕ ДЛЯ ИСПЫТАНИЯ

Если в частной монографии не указано иное, используют 10 г или 10 мл испытуемого

лекарственного средства с соблюдением мер предосторожности, указанных выше. Для

жидкостей или твердых веществ в аэрозольной форме отбирают 10 контейнеров. Для

трансдермальных пластырей берут 10 образцов. Для ородисперсных пленок образец

составляет 10 пленок.

Испытуемое количество может быть уменьшено для активных фармацевтических

субстанций, которые будут использованы в следующих условиях: количество на единицу

дозированной лекарственной формы (например, таблетку, капсулу, инъекцию) составляет не

более 1 мг или количество на грамм или миллилитр (для препаратов, не представленные в

виде дозированных единиц) составляет менее 1 мг. В этих случаях испытуемое количество

должно быть не менее количества, присутствующего в 10 единицах дозированной

лекарственной формы или 10 г или 10 мл лекарственного средства.

Таблица 2.6.12. –3. – Значения наиболее вероятной численности микроорганизмов

Количество пробирок с наблюдаемым ростом

микроорганизмов

НВЧ на грамм

или

миллилитр

препарата

95 %

доверительный

интервал

Количество граммов или миллилитров

препарата в пробирке

0.1

0.01

0.001

0 – 9.4

0.1 – 9.5

0.1 – 10

6.1

1.2 – 17

6.2

1.2 – 17

9.4

3.5 – 35

3.6

0.2 – 17

7.2

1.2 – 17

4 – 35

7.4

1.3 – 20

4 – 35

5 – 38

9.2

1.5 – 35

4 – 35

5 – 38

4 – 38

5 – 38

9 – 94

5 – 40

9 – 94

5 – 94

9 – 104

16 – 181

9 – 181

17 – 199

120

30 – 360

160

30 – 380

18 – 360

150

30 – 380

210

30 – 400

290

90 – 990

240

40 – 990

460

90 – 1980

1100

200 – 4000

 1100

Для материалов, используемых в качестве активных субстанций, когда количество образцов

ограничено или размер серии чрезвычайно мал (т. е. менее 1000 мл или 1000 г), испытуемое

количество должно составлять 1 % от серии, если не предписано, не обосновано и не

разрешено меньшее количество.

Для лекарственных средств, общее число единиц в серии составляет менее 200 (например,

образцы, используемые в клинических испытаниях), размер выборки может быть уменьшен

до 2 единиц или до 1 единицы, если размер серии менее 100.

Произвольно отбирают образец (образцы) из сыпучего материала или из доступных

контейнеров с препаратом. Для получения необходимого количества образца смешивают

содержимое достаточного числа контейнеров.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Мембранная фильтрация

Используют устройство для фильтрации, предназначенное для переноса фильтра в

питательную среду. Образец приготавливают, используя подходящей методики, как описано

в разделе «ПРОВЕРКА РОСТОВЫХ СВОЙСТВ, ПРИГОДНОСТЬ МЕТОДА ПОДСЧЕТА И

ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ», переносят соответствующее количество на каждый из

двух мембранных фильтров и немедленно фильтруют. Промывают каждый фильтр,

используя подходящую методику. Для определения общего числа аэробных

микроорганизмов (TAMC) один из мембранных фильтров переносят на поверхность соево-

казеинового агара. Для определения общего числа дрожжевых и плесневых грибов (TYMC)

другой мембранный фильтр переносят на поверхность Сабур–декстрозного агара.

Инкубируют чашку с соево–казеиновым агаром при температуре (30 – 35) °C в течение 3–5

сут, а чашку с Сабуро-декстрозным агаром – при температуре (20 – 25) °C в течение 5 – 7

сут. Рассчитывают число КОЕ на грамм или на миллилитр испытуемого лекарственного

средства.

При испытании трансдермальных пластырей или диспергируемых пленок фильтруют 10 %

объема препарата, описанного в разделе «Подготовка испытуемого образца», отдельно через

каждый из 2 стерильных мембранных фильтров. Переносят один мембранный фильтр на

соево–казеиновый агар для подсчета TAMC, а другую мембрану на Сабуро–декстрозный агар

для подсчетаTYMC.

Методы подсчета на чашках

Метод глубинного посева

Образец приготавливают, используя подходящую методику, описанную в разделе 4. Для

каждой среды используют не менее двух чашек Петри на каждый уровень разбавления.

Инкубируют чашки с соево–казеиным агаром при температуре от 30 °C до 35 °C в течение 3 –

5 сут, чашки с Сабуро–декстрозным агаром при температуре от 20 °C до 25 °C в течение 5 – 7

сут. Выбирают чашки, соответствующие данному разведению и показывающие наибольшее

количество колоний не более 250 для TAMC и 50 для TYMC. Используя, среднее

арифметическое на культуральную среду подсчетов, рассчитывают количество КОЕ на грамм

или миллилитр продукта.

Метод поверхностного посева

Приготавливают образец, используя подходящий метод, как описано в разделе 4. Используют

не менее 2 чашек Петри для каждой среды и каждого уровня разведения. Для инкубации и

подсчета числа КОЕ действуют так же, как описано для метода подсчета на чашках.

Метод наиболее вероятного числа

Образец готовят и разбавляют с использованием методики, пригодность которой была

доказана в соответствии с разделом «ПРОВЕРКА РОСТОВЫХ СВОЙСТВ, ПРИГОДНОСТЬ

МЕТОДА ПОДСЧЕТА И ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ». Все пробирки инкубируют при

температуре от 30 °C до 35 °C в течение 3 – 5 сут. Если необходимо, проводят пересев, с

использованием подходящей методики. Регистрируют количество пробирок, в которых

наблюдается микробный рост для каждого уровня разведения. Определяют наиболее

вероятное число микроорганизмов на грамм или миллилитр испытуемого лекарственного

средства по таблице 2.6.12.–3.

5-3. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ

Общее число аэробных микробов (TAMC) считается эквивалентным числу КОЕ,

обнаруженных на соево–казеиновом агаре; при обнаружении на этой среде колоний грибов

их подсчитывают как часть общего числа аэробных микробов (ТАМС). Общее

комбинированное число дрожжей/плесневых грибов (TYMC) считается эквивалентным числу

КОЕ, обнаруженных на Сабуро–декстрозном агаре; если на этой среде обнаруживаются

колонии бактерий, они учитываются как часть общего числа дрожжей и плесневелых грибов

(TYMC). Когда ожидается, что TYMC превысит критерий приемлемости из-за роста

бактерий, можно использовать Сабуро-декстрозный агар, содержащий антибиотики. Если

подсчет ведется методом наиболее вероятного числа расчетным значением является TAMC.

Установленный критерий приемлемости для микробиологического качества

интерпретируется следующим образом:

– 10

КОЕ: максимально допустимое количество равно 20;

– 10

КОЕ: максимально допустимое количество равно 200;

– 10

КОЕ: максимально допустимое количество равно 2000 и т. д.

Рекомендуемые растворы и питательные среды описаны в общей монографии 2.6.13.