3/1/:20614
2.6.14. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОКСИНЫ
Испытание на бактериальные эндотоксины применяют для количественного определения
эндотоксинов грамотрицательных бактерий с использованием лизата амëбоцитов
мечехвоста (Limulus polyphemus или Tachypleus tridentatus). Существует три метода проведе-
ния данного испытания: гель-тромб метод, основанный на образовании тромба (геля);
турбидиметрический метод, основанный на помутнении в результате расщепления
эндогенного субстрата; хромогенный метод, основанный на появлении окраски после
расщепления синтетического пептидно-хромогенного комплекса.
В настоящем разделе описаны шесть методов:
Метод А. Метод гель-тромба: испытание на предельное содержание
Метод В. Метод гель-тромба: количественное испытание
Метод С. Турбидиметрический кинетический метод
Метод D. Хромогенный кинетический метод
Метод Е. Хромогенный метод конечной точки
Метод F. Турбидиметрический метод конечной точки
Испытание выполняют любым из этих шести методов. В сомнительных или спорных
случаях окончательное решение принимают, основываясь на результатах метода А, при
отсутствии других указаний в частной монографии.
Испытание выполняют в условиях, не допускающих загрязнения посторонними
эндотоксинами.
ОБОРУДОВАНИЕ
Всю стеклянную посуду и другую термоустойчивую аппаратуру депирогенизируют в
сухожаровом шкафу в соответствии с валидированной процедурой. Как правило,
минимальные значения времени и температуры обработки составляют 30 мин и 250 ºС,
соответственно. При использовании расходных материалов из полимерных материалов,
таких как микропланшеты и наконечники для автоматических пипеток, должно быть
доказано, что используемое устройство не содержит обнаруживаемого количества
эндотоксинов, мешающих проведению испытания.
ПРИМЕЧАНИЕ: в данном разделе термин «пробирка» включает в себя все типы сосудов,
например, лунки микропланшета.
РЕАКТИВЫ, ИСПЫТУЕМЫЕ РАСТВОРЫ
Лизат амëбоцитов
Лизат амëбоцитов ‒ лиофилизированный реактив, полученный из лизата амëбоцитов
мечехвоста (Limulus polyphemus или Tachypleus tridentatus). Необходимо использовать лизат
амëбоцитов, предназначенный для выбранного метода определения бактериальных
эндотоксинов, произведенный в соответствии с требованиями уполномоченного органа.
ПРИМЕЧАНИЕ: лизат амëбоцитов помимо эндотоксинов реагирует с некоторыми β-
глюканами. Доступны лизаты амëбоцитов, не реагирующие с глюканами: их получают или
удалением из лизата амебоцитов G-фактора, который реагирует с глюканами, или
ингибированием реакционной системы G-фактора. Такие реактивы можно использовать
для испытания на эндотоксины в присутствии глюканов.
Раствор лизата
Лизат амëбецитов растворяют, осторожно перемешивая, в воде для испытания на
бактериальные эндотоксины или в буферном растворе, рекомендованном производителем
лизата. Восстановленный раствор лизата хранят в холодильнике или морозильной камере в
соответствии с рекомендациями производителя.
Вода для испытания на бактериальные эндотоксины
Вода для инъекций Р или вода, полученная другими способами, не проявляющая реакции с
используемым лизатом на пределе обнаружения реагента.
ПОДГОТОВКА РАСТВОРА СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА БАКТЕРИАЛЬНОГО
ЭНДОТОКСИНА
Для приготовления основного раствора стандартного образца эндотоксина используют
стандартный образец эндотоксина, калиброванный относительно Международного
стандартного образца, например, СО ГФ РК (EP BRP) Стандарт бактериального
эндотоксина.
Количественное содержание бактериального эндотоксина выражают в Международных
единицах. За международную единицу принимают активность определенного количества
Международного стандартного образца бактериального эндотоксина, устанавливаемого
Всемирной организацией здравоохранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одна международная единица эндотоксина соответствует одной
единице эндотоксина.
Основной раствор стандартного образца эндотоксина готовят и хранят в соответствии с
инструкциями производителя.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА БАКТЕРИАЛЬНОГО
ЭНДОТОКСИНА
Соответствующие последовательные разведения готовят из предварительно тщательно
перемешанного основного стандартного раствора эндотоксина с использованием воды для
испытания на бактериальные эндотоксины. Приготовленные растворы используют в
возможно короткие сроки, чтобы избежать потери активности вследствие адсорбции.
ПОДГОТОВКА ИСПЫТУЕМЫХ РАСТВОРОВ
Испытуемые растворы готовят разведением испытуемых образцов для фармацевтического
применения или лекарственных препаратов с использованием воды для испытания на
бактериальные эндотоксины. Для некоторых субстанций для фармацевтического
применения или лекарственных препаратов более подходящим является разведение с
использованием других растворителей. При необходимости, доводят значение рН
испытуемого раствора так, чтобы рН смеси лизата с испытуемым раствором находилось в
интервале, предписанном производителем лизата, обычно от 6.0 до 8.0. Значение рН может
быть доведено с использованием кислоты, основания или подходящего буферного раствора
в соответствии с рекомендациями производителя лизата. Кислоты и основания могут быть
приготовлены из концентратов или порошков с использованием воды для испытания на
бактериальные эндотоксины в емкостях, не содержащих обнаруживаемых эндотоксина в
испытании. Буферные растворы должны быть проверены на отсутствие обнаруживаемых
количеств эндотоксина и мешающих факторов.
МАКСИМАЛЬНО ДОПУСТИМОЕ РАЗВЕДЕНИЕ
Максимально допустимое разведение представляет собой наибольшее разведение
испытуемого образца, при котором может быть определено предельно допустимое
содержание эндотоксинов. Оно зависит от предельного содержания эндотоксинов и
чувствительности лизата амëбоцитов (предела обнаружения). Максимально допустимое
разведение рассчитывают по формуле:
Предельное содержание эндотоксинов. Для лекарственных препаратов, вводимых
парентерально, предельное содержание эндотоксинов, определенное на основе дозы,
рассчитывают по формуле:
где:
К предельная пирогенная доза бактериальных эндотоксинов из расчета на
килограмм массы тела;
М максимальная разовая доза испытуемого лекарственного препарата из
расчета на килограмм массы тела.
В случае введения лекарственного препарата через частые интервалы или инфузионно, в
качестве М используют общую максимальную дозу, вводимую в течение одного часа.
Предельное содержание эндотоксинов для активных фармацевтических субстанций,
предназначенных для парентерального введения, указывают в частной монографии и
выражают в таких единицах, как МЕ/мл, МЕ/мг, МЕ/ единицу биологической активности и
т.д.
Концентрацию испытуемого раствора выражают:
в миллиграммах на миллилитр (мг/мл), если предельное содержание эндотоксинов
выраженно в массовых единицах (МЕ/мг);
в единицах активности на миллилитр (Ед/мл), если предельное содержание эндотоксинов
выражено в пересчете на единицу биологической активности (МЕ/Ед);
М
К
в миллилитрах на миллилитр (мл/мл), если предельное содержание эндотоксинов
выражено в объемных единицах (МЕ/мл).
Значение (предел обнаружения) представляет собой чувствительность лизата в гель-тромб
методе (МЕ/мл), заявленная производителем лизата амëбоцитов или самая низкая
концентрация эндотоксинов, определенная по стандартной калибровочной кривой в
турбидиметрическом или хромогенном методах.
МЕТОД ГЕЛЬ-ТРОМБА (МЕТОДЫ А И В)
Метод гель-тромб позволяет определять наличие и количество бактериальных
эндотоксинов и основан на эффекте превращения лизата амебоцитов в гель в присутствии
эндотоксинов. Минимальная концентрация эндотоксинов, требующаяся для образования
геля лизата в стандартных условиях, представляет собой указанную в инструкции
производителя чувствительность лизата. Для обеспечения точности и достоверности
испытания следует подтвердить указанную чувствительность лизата, а также провести
испытание на мешающие факторы, описанное в разделе 1. Предварительные испытания.
ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ
Подтверждение заявленной чувствительности лизата
Перед использованием лизата в испытаниях на чувствительность λ, указанную
производителем и выраженную в МЕ/мл, следует подтвердить в четырех повторах.
Подтверждение чувствительности лизата проводят при использовании новой партии лизата
или при любом изменении условий испытания, способном повлиять на его результат.
Готовят растворы стандартного образца не менее чем в четырех концентрациях,
эквивалентных 2 λ, λ, 0.5 λ и 0.25 λ, путем разбавления основного раствора стандартного
образца эндотоксина водой для испытания на бактериальные эндотоксины.
В каждой пробирке смешивают раствор лизата с равным объемом одного из растворов
стандартного образца (например, по 0.1 мл каждого). Если используют одноразовые
флаконы или ампулы с лиофилизированным лизатом, растворы прибавляют
непосредственно в ампулу или флакон. Смесь растворов инкубируют в течение
определенного периода в соответствии с рекомендациями производителя лизата (обычно
при температуре (37 ± 1) ºС в течение (60 ± 2) мин), избегая вибрации. По истечении
указанного срока визуально регистрируют результаты исследуя целостность и плотность
геля. Для этого каждую пробирку поочередно извлекают из инкубирующего устройства и
переворачивают одним плавным движением приблизительно на 180º. Если образовался
плотный гель, не разрушающийся при переворачивании, результат регистрируют как
положительный. Если такой гель не образовался, результат считают отрицательным.
Результаты испытания считают удовлетворительными, если наименьшая концентрация рас-
творов стандартного образца дает отрицательный результат во всех повторных испытаниях.
За конечную точку принимают последний положительный результат в нисходящем ряду
концентраций стандартного образца эндотоксина с наименьшей концентрацией.
Рассчитывают среднее значение логарифмов концентраций в конечных точках четырех
серий разведений, затем берут антилогарифм этого значения и определяют среднее гео-
метрическое значений концентраций в конечной точке по следующей формуле:
Среднее геометрическое значение концентрации конечной точки = антиlog
где:
Ʃе ‒ сумма десятичных логарифмов (lg) концентраций в конечных точках в
используемых разведениях;
f – число повторностей.
Среднее геометрическое значение концентрации в конечной точке представляет собой
измеренную чувствительность раствора лизата (МЕ/мл). Если это значение составляет не
менее 0.5 λ и не более 2 λ, заявленную чувствительность, считают подтвержденной и
используют в испытаниях, выполняемых с этим лизатом.
(Мешающие факторы
Готовят растворы А, В, С и D в соответствии с таблицей 2.6.14.-1 и используют испытуемые
растворы в разведениях меньше чем максимально допустимое разведение, не содержащих
эндотоксины в обнаруживаемых концентрациях, рассчитанных как описано в разделе 1.
Предварительные испытания (i) Подтверждение заявленной чувствительности лизата.
Среднее геометрическое значение концентрации в конечной точке растворов В и С
определяют используя формулу, описанную в разделе 1. Предварительные испытания (i)
Подтверждение заявленной чувствительности лизата.
Испытание на мешающие факторы должны быть повторены в случае любых изменений
условий испытания, которые могут повлиять на его результат.
Результаты испытания считают удовлетворительными, если растворы А и D во всех
повторных испытаниях дают отрицательный результат, а результат, полученный для
раствора С, совпадает с чувствительностью лизата, указанной производителем.
Если чувствительность лизата, определенная для раствора В, не менее 0.5 λ и не более 2λ,
испытуемый раствор в условиях испытания не содержит мешающих факторов. В противном
случае испытуемый раствор оказывает влияние на результаты испытания.
Таблица 2.6.14.-1
Раствор
Концентрация
эндотоксина
/Раствор
с добавлением
эндотоксина
Растворитель
Коэффициен
т разведения
Концентрация
СО образца
эндотоксина
Количество
повторностей
А
Нет/
Испытуемый
раствор
–
–
–
4
В
2 λ /
Испытуемый
раствор
Испытуемый
раствор
1
2
4
8
2 λ
1 λ
0.5 λ
0.25 λ
4
4
4
4
С
2 λ /
Вода для
Вода
для
1
2
2 λ
1 λ
2
2
испытания на на
бактериальные
эндотоксины
испытания на
бактериальные
эндотоксины
4
8
0.5 λ
0.25 λ
2
2
D
Нет /
Вода для
испытания на
бактериальные
эндотоксины
–
–
–
2
–
–
2
Раствор А ‒ раствор испытуемого образца, не содержащий обнаруживаемых эндотоксинов.
Раствор В ‒ испытание на мешающие факторы.
Раствор С ‒ контроль чувствительности, указанной производителем
Раствор D ‒ отрицательный контроль (вода для испытания на бактериальные эндотоксины).
Если испытуемый образец оказывает влияние на результат испытания при разведениях ме-
нее максимально допустимое разведение, испытание на мешающие факторы повторяют с
использованием больших разведений, но не превышающих максимально допустимое
разведение. Использование более чувствительного лизата позволяет использовать большие
разведения испытуемого образца, и это может содействовать исключению мешающих
факторов, что может способствовать устранению интерференции.
Мешающие факторы могут быть удалены соответствующей обработкой после валидации,
например, фильтрацией, нейтрализацией, диализом или тепловой обработкой. Для
подтверждения, что выбранный метод эффективно исключает мешающие факторы, не
удаляя эндотоксины, испытания повторяют с использованием лекарственного препарата, к
которому был добавлен стандартный образец эндотоксина и проведена выбранная процеду-
ра удаления мешающих факторов.
ИСПЫТАНИЕ НА ПРЕДЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ (МЕТОД А)
Методика
Готовят растворы А, В, С и D в соответствии с таблицей 2.6.14.-2 и выполняют испытание
для этих растворов в соответствии с указаниями в разделе 1. Предварительные испытания
Подтверждение заявленной чувствительности лизата.
Готовят растворы А и В (положительный контроль в разведениях не выше МДР и
обрабатывают их, как описано в разделе 1. Предварительные испытания (ii). Определение
мешающих факторов. Растворы В и С (положительные контроли) содержат стандарт
эндотоксина в концентрации, соответствующей двукратной чувствительности, указанной
производителем. Раствор D (отрицательный контроль) представляет собой воду для
испытания на бактериальные эндотоксины.
Таблица 2.6.14.-2
Раствор
Концентрация эндотоксина /
Раствор, с добавлением эндотоксина
Количество
повторностей
А
Нет /разбавленный испытуемый раствор
2
В
2λ/разбавленный испытуемый раствор
2
С
2λ/ Вода для испытания на бактериальные эндотоксины
2
D
Нет/ Вода для испытания на бактериальные эндотоксины
2
Результаты и интерпретация
Результаты испытания считают удовлетворительными, если:
для растворов В и С в обеих повторностях получены положительные результаты;
для раствора D в обеих повторностях получены отрицательные результаты.
Если для раствора А в двух повторностях получены отрицательные результаты,
испытуемый образец выдерживает испытание. Если для раствора А в двух повторностях
получены положительные результаты, испытуемый образец не выдерживает испытание.
Если положительный результат получен только в одной из повторностей для раствора А, то
испытание повторяют. Испытуемый образец выдерживает испытание, если для раствора А
при повторном испытании в двух повторностях получены отрицательные результаты.
Испытуемый образец не выдерживает испытание, если для раствора А в одном или обоих
повторностях испытания получен положительный результат.
Если для испытуемого образца в разведении, меньшем максимально допустимом
разведении, в двух повторностях получены положительные результаты, испытание может
быть проведено повторно с использованием большего разведения, но не превышающего
максимально допустимого разведения.
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ (МЕТОД В)
Методика
С помощью данного метода определяют количество бактериальных эндотоксинов путем
титрования до конечной точки. Готовят растворы А, В, С и D в соответствии с таблицей
2.6.14.-3 и выполняют испытание для данных растворов в соответствии с указаниями
раздела 1. Предварительные испытания (i) Подтверждение заявленной чувствительности
лизата.
(i) Результаты и интерпретация
Результаты испытания считают удовлетворительными при выполнении следующих трех
условий:
(а) для раствора D (отрицательный контроль) получены отрицательные результаты в двух
повторностях;
(б) для раствора В (положительный контроль) получены положительные результаты в двух
повторностях;
(с) для растворов С (положительный контроль) среднее геометрическое значение
концентрации бактериальных эндотоксинов составляет не менее 0.5λ и не более 2λ.
Для определения концентрации эндотоксина в растворе А рассчитывают концентрацию в
конечной точке для каждой повторности путем умножения каждого коэффициента
разведения в конечной точке на λ.
За концентрацию эндотоксина в испытуемом растворе принимают значение концентрации в
конечных точках повторных испытаний. Если испытание проводят с разведенным
испытуемым раствором, концентрацию эндотоксина в исходном растворе получают путем
умножения на фактор разведения.
Если во всех повторностях серии растворов А получены отрицательные результаты,
концентрацию бактериальных эндотоксинов в испытуемом образце регистрируют как
«менее λ (чувствительности лизата амебоцитов)» (или, если использовали разведенный
образец ‒ как произведение «менее λ» и наименьшего коэффициента разведения образца).
Если для всех разведений получен положительный результат, концентрацию эндотоксина
определяют как «равную или превышающую максимальный коэффициент разведения,
умноженный на λ (например, в таблице 2.6.14.-3 это значение равно исходному
коэффициенту разведения × 8 × λ).
Лекарственный препарат выдерживает испытание, если концентрация эндотоксина в обоих
повторных испытаниях меньше указанной в частной монографии.
Таблица 2.6.14.-3
Раствор
Концентрация
эндотоксина
/Раствор,
с добавлением
эндотоксина
Растворитель
Коэффицие
нт
разведения
Концентрация
СО образца
эндотоксина
Количество
повторностей
А
Нет/
Испытуемый
раствор
Вода для
испытания на
бактериальные
эндотоксины
1
2
4
8
–
–
–
–
2
2
2
2
В
2 λ /
Испытуемый
раствор
Испытуемый
раствор
1
2 λ
2
С
2 λ /
Вода для
испытания на
бактериальные
эндотоксины
Вода для
испытания на
бактериальные
эндотоксины
1
2
4
8
2 λ
1 λ
0.5 λ
0.25 λ
2
2
2
2
D
Нет /
Вода для
испытания на
бактериальные
эндотоксины
–
–
–
2
–
–
2
Раствор А – испытуемый раствор с разведением не превышающем МДР, с которым
проведено испытание на мешающие факторы. Последующие разведения испытуемого
раствора не должны превышать МДР. Используют воду для испытаний на бактериальные
эндотоксины для приготовления серии разведений испытуемого раствора из четырех
емкостей в отношениях 1, ½, ¼ и ⅛ к разведению, с которым проводят определение
мешающих факторов. Могут быть также использованы другие соответствующие
разведения.
Раствор В – раствор А, содержащий стандартный образец эндотоксина в концентрации 2λ
(положительный контроль).
Раствор С – серии разведений из четырех емкостей воды для испытания на бактериальные
эндотоксины, содержащей стандарт эндотоксина в концентрациях 2λ, λ, 0.5λ, 0.25λ .
Раствор D – вода для испытания на бактериальные эндотоксины (отрицательный контроль).
ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (С, D, E и F)
ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (С,F)
Турбидиметрические методы основаны на фотометрическом измерении увеличения
мутности. В зависимости от принципа, положенного в основу проведения испытания
различают турбидиметрический метод по конечной точке и кинетическое турбиди-
метрический метод.
Турбидиметрический метод по конечной точке (метод F) основан на количественном
соотношении между концентрацией эндотоксинов и мутностью (поглощение или
пропускание света) реакционной смеси в конце инкубационного периода.
Кинетический турбидиметрический метод (метод С) основан либо на измерении времени,
необходимого для достижения заданного значения поглощения (оптической плотности) в
реакционной смеси, либо в определении скорости увеличения мутности.
Испытание проводят при температуре инкубации, рекомендованной производителем
лизата, обычно (37 ± 1) ºС.
ХРОМОГЕННЫЕ МЕТОДЫ (МЕТОДЫ D, E)
Хромогенные методы используют для измерения хромофора, высвобождаемого из
соответствующего хромогенного субстрата при взаимодействии эндотоксинов с лизатом. В
зависимости от принципа, положенного в основу проведения испытания различают
хромогенный метод по конечной точке и кинетический хромогенный метод.
Хромогенный метод по конечной точке (метод Е) основан на количественном соотношении
между концентрацией эндотоксина и количеством хромофора, высвобождаемого в конце
инкубационного периода.
Кинетический хромогенный метод (метод D) основан либо на измерении времени, необхо-
димого для достижения заданного значения поглощения (оптической плотности) в
реакционной смеси, либо в определении скорости появления окраски.
Испытание проводят при температуре инкубации, рекомендованной производителем лизата
(обычно (37 ± 1) ºС).
ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИСПЫТАНИЯ
Предварительные испытания проводят для обеспечения точности и надежности результатов
испытания турбидиметрическим и хромогенным методом. При выполнении
предварительных испытаний подтверждают достоверность критериев для стандартной
кривой и отсутствие мешающих факторов в испытуемом растворе, влияющих на результаты
испытания. При внесении в условия испытания любых изменений, которые могут повлиять
на результаты, требуется проведение валидации методики.
Проверка достоверности критериев стандартной кривой
Испытание должно быть проведено для каждой партии лизата амëбоцитов. Для получения
калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина готовят не менее трех
концентраций стандартного образца эндотоксина в диапазоне, рекомендованном
производителем лизата. Для каждого раствора проводят испытание не менее чем в трех
повторностях в соответствии с рекомендациями производителя лизата (объемные отно-
шения, время инкубации, температура, рН и т.д.).
Если при использовании кинетических методов необходимо построить стандартную
кривую с диапазоном стандартного образца эндотоксинов, превышающим 2 lg значения
концентрации эндотоксина для каждого изменения интервала измерения на lg значения
концентраций эндотоксина, в испытание необходимо включить раствор стандартного
образца эндотоксина соответствующей концентрации.
В диапазоне концентраций эндотоксина, указанном производителя лизата, абсолютное
значение коэффициента корреляции |r| должно быть равно или более 0.980.
Мешающие факторы
Выбирают концентрацию эндотоксина в центре или недалеко от центра кривой
стандартного образца эндотоксина.
Готовят растворы А, В, С, D в соответствии с таблицей 2.6.14–4. С каждым из указанных
растворов проводят не менее двух повторностей в соответствии с рекомендациями
производителя лизата (объем испытуемого раствора и раствора лизата, объемное
соотношение испытуемого раствора и раствора лизата, время инкубации и т.д.).
Таблица 2.6.14.-4.
Раствор
Концентрация эндотоксина
Раствор с добавлением
эндотоксина
Количество
повторностей
А
Нет
Испытуемый раствор
Не менее 2
В
Средняя концентрация на
стандартной кривой
Испытуемый раствор
Не менее 2
С
Не менее 3 концентраций
(наименьшая концентрации,
обозначенная λ)
Вода для испытания на
бактериальные
эндотоксины
Не менее 2 для
каждой
концентрации
D
Нет
Вода для испытания на
бактериальные
эндотоксины
Не менее 2
Раствор А – испытуемый раствор, который может быть разбавлен, не превышая МДР.
Раствор В – испытуемый образец в выбранном разведении (раствор А), к которому
добавлен стандартный образец эндотоксина. Конечная концентрация эндотоксина в
растворе должна соответствовать или быть близкой среднему значению концентраций
стандартного образца эндотоксина, использованных для построения кривой стандартного
образца эндотоксина (положительный контроль испытуемого образца).
Раствор С – раствор стандартного образца эндотоксина в концентрациях, применяемых для
валидации метода в соответствии с указанием раздела Предварительные испытания
подраздела Обеспечение выполнения критериев кривой стандартного образца
(положительный контроль).
Раствор D – вода для испытания на бактериальные эндотоксины (отрицательный контроль).
Результаты испытания считают удовлетворительными при выполнении следующих
условий:
‒ абсолютное значение коэффициента корреляции стандартной кривой, полученной с ис-
пользованием раствора С, превышает или равно 0.980;
‒ результат, полученный с раствором D, не превышает предельного значения для контроля,
указанного в описании используемого лизата, или он меньше, чем предел обнаружения
эндотоксина с используемым лизатом.
Рассчитывают среднее значение извлекаемости прибавленного эндотоксина путем
вычитания средней концентрации эндотоксина в растворе (при наличии) (раствор А,
таблица 2.6.14.– 4.) из его концентрации в растворе, содержащем прибавленный эндотоксин
(раствор В, таблица 2.6.14.-4).
Испытуемый раствор считают свободным от мешающих факторов, если в условиях
испытания измеренная концентрация эндотоксина, добавленного в испытуемый раствор,
находится в пределах от 50 % до 200 % от известной концентрации прибавленного
эндотоксина, полученной после вычитания концентрации эндотоксина, обнаруженного в
растворе без добавления эндотоксина.
Считают, что испытуемый раствор содержит мешающие факторы, если извлекаемость
эндотоксина выходит за заданные пределы. Повторяют испытание, используя большие раз-
ведения, не превышающее максимально допустимые разведения. Кроме того, мешающее
влияние испытуемого раствора или испытуемого раствора в разведении, не превышающем
максимально допустимые разведения, может быть исключено подходящим способом после
валидации, например, фильтрацией, нейтрализацией, диализом или термической
обработкой. Для подтверждения, что выбранный способ эффективно исключает мешающие
факторы без потери эндотоксинов, повторяют испытание на мешающие факторы с
использованием испытуемого образца, к которому был прибавлен стандартный раствор
эндотоксинов с последующей обработкой выбранным способом.
ИСПЫТАНИЕ
Методика
Следуют указаниям, приведенным в разделе Предварительные испытания, подразделе
Мешающие факторы.
Результаты
Для раствора А в каждой повторности рассчитывают концентрацию эндотоксинов,
используя калибровочную кривую стандартного образца, полученную с помощью раствора
С (положительный контроль).
Результаты испытания считают удовлетвоительными при выполнении следующих условий:
1) результаты, полученные для раствора С, соответствуют требованиям, приведенным в
разделе Предварительные испытания, подразделе Проверка достоверности
критериев стандартной кривой;
2) извлекаемость эндотоксина, рассчитанная из концентрации эндотоксина,
обнаруженной в растворе В, после вычитания концентрации эндотоксина,
определенной в растворе А, находится в пределах от 50 % до 200 %.
3) результат, полученный для раствора D (отрицательный контроль), не превышает
предельное контрольное значение, указанное в инструкции используемого лизата,
или меньше предела обнаружения эндотоксина для используемого лизата.
Интерпретация результатов
Испытуемые образцы субстанции для фармацевтического применения или лекарственного
препарата соответствует требованиям испытания, если средняя концентрация эндотоксина в
повторностях раствора А (с учетом разведения и концентрации испытуемого образца)
меньше предельного содержания эндотоксинов для данного продукта.
Рекомендации по применению испытания на бактериальные эндотоксины приведены в
общем разделе 5.1.10. Применение испытания на бактериальные эндотоксины.
