3/1:20715

2.7.15. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГЕННОЙ АКТИВНОСТИ

ВАКЦИНЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ГЕПАТИТА В (РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК)

Количественное определение антигенной активности вакцины для профилактики гепатита В

(pекомбинантной ДНК) проводят либо in vivo путем сравнения ее способности в определенных

условиях индуцировать выработку специфических антител к поверхностному антигену вируса

гепатита В (HBsAg) у мышей или морских свинок с такой же способностью стандартного

образца (метод 1) либо in vitro, методом иммунохимического определения содержания

антигена (метод 2).

МЕТОД 1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ IN VIVO

Метод основан на определении дозы вакцины, вызывающей образование антител к

поверхностному антигену вируса гепатита В (HBsAg) у 50 % животных.

Выбор и распределение животных. В испытании используют здоровых мышей из одной

партии (стока), возрастом около 5 недель. Линия мышей, используемая в данном испытании

должна обеспечивать получение значительного наклона кривой зависимости отклика (реакции

на антиген) от дозы антигена (доза − отклик). Подходящими являются мыши гаплотипов Н-2

или H-2

. Также возможно использование здоровых морских свинок из одной партии,

возрастом около 7 недель и весом от 300 г до 350 г. Все животные должны быть одного пола и

возраста. Животных делят не менее чем на 7 равных групп в количестве, необходимом для

выполнения требований испытания.

Определение активности испытуемого образца. Готовят не менее трех разведений

испытуемого образца и соответствующих разведений стандартного образца, используя раствор

9 г/л натрия хлорида Р с добавлением алюминиевого адъюванта, применяемого для

производства вакцины, или другой подходящий растворитель. Каждое из разведений

назначают одной из групп животных; каждому животному в группе вводят внутрибрюшинно

не более 1.0 мл разведения, назначенного данной группе животных. Контрольной

невакцинированой группе вводят внутрибрюшинно растворитель в том же объѐме, что и

испытуемый образец. Через соответствующий промежуток времени (например, от 4 недель до

6 недель) всех животных анестезируют, затем производят забор крови, готовят сыворотки и

хранят их отдельно друг от друга. Определяют количественное содержание специфических

антител против HBsAg в каждом образце сыворотки с помощью подходящего

иммунохимического метода (2.7.1).

Расчеты. Вычисления проводят с помощью статистических методов, предназначенных для

количественных определений с качественным (альтернативным) типом ответа (5.3).

На основании распределения уровней реакции, определѐнных во всех сыворотках группы

невакцинированных животных, вычисляют максимальный уровень реакции, который можно

ожидать у невакцинированных животных для данного испытания. Любой иммунный ответ в

группе вакцинированных животных, превышающий данный уровень, является по

определению сероконверсией.

Проводят подходящее преобразование (например, пробит-преобразование) процентной

численности животных с сероконверсией в каждой из групп и анализируют данные с помощью

модели параллельных прямых логарифмической зависимости доза−отклик. Определяют

активность испытуемого образца относительно стандартного образца.

Критерии достоверности. Результаты испытания считают достоверными, если:

− ED

как для испытуемого образца, так и для стандартного образца находится в пределах от

наименьшей до наибольшей дозы, вводимой животным;

− статистический анализ не показывает значительного отклонения от линейности и

параллельности;

− доверительный интервал (Р = 0.95) относительной активности составляет не менее 33 % и не

более 300 % от установленной активности.

Требование для относительной активности. Верхняя граница доверительного интервала (Р

= 0.95) вычисленной относительной активности должна быть не менее 1.0.

МЕТОД 2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ IN VITRO

Содержание антигена вируса гепатита В определяют иммунохимическим методом (2.7.1) с

учетом критериев допустимости, установленных по результатам при валидации методики

испытания in vivo.

Для количественного определения можно применять метод твердофазного

иммуноферментного анализа и радиоиммунологический метод анализа с использованием

моноклональных антител, специфичных в отношении иммуногенных эпитопов HBsAg. Для

испытания используют подходящее количество разведений испытуемого образца и

стандартного образца. Полученные данные анализируют с помощью модели параллельных

прямых. Для определения HBsAg in vitro возможно использование коммерческих тест-систем,

адаптированных к оценке количественного определения антигенной активности in vitro.

Критерии пригодности для используемого стандартного образца утверждает уполномоченный

орган на основании результатов валидации.