3/1:20702

2.7.2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИБИОТИКОВ

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

Активность антибиотиков определяют путем сравнения степени угнетения роста

чувствительных микроорганизмов под действием испытуемого образца и стандартного

образца в определенной концентрации.

выбрана модель параллельных прямых, линии логарифмической зависимости активности

(или преобразованный ответ) от дозы для испытуемого образца и стандартного образца

должны быть параллельны; они должны быть линейны в диапазоне доз, используемых в

расчетах. Выполнение этих условий должно быть подтверждено методами для

определения достоверности при установленном уровне значимости, обычно P = 0.05.

Могут быть использованы и другие математические методы, например, с помощью метода

угловых коэффициентов, при условии подтверждения статистической достоверности

результатов.

При отсутствии других указаний в частной монографии доверительные интервалы

Питательную среду, подходящую для испытания, расплавляют и вносят в нее при

соответствующей температуре, например, от 45 °С до 50 °С для вегетативных форм,

определенное количество суспензии микроорганизмов, чувствительных к испытуемому

образцу антибиотика. Количество внесенной суспензии микроорганизмов должно

обеспечивать при всех концентрациях антибиотика, используемых при испытании,

четкость зон угнетения его роста подходящего диаметра. Питательную среду тотчас после

инокуляции тест-штаммов микроорганизма разливают в чашки Петри или большие

прямоугольные чашки до образования однородного слоя толщиной от 2 мм до 5 мм. В

качестве альтернативы, допускается разливать питательную среду в два слоя, при этом

Готовят растворы стандартного образца и испытуемого образца антибиотика известной

концентрации и предположительно одинаковой активности, используя представленные в

таблице 2.7.2.−1 растворитель и буферный раствор. Растворы наносят на поверхность

среды, например в стерильных цилиндрах из фарфора, нержавеющей стали или другого

подходящего материала, или в лунки, подготовленные в толще агара. Во все цилиндры

или лунки каждой чашки вносят одинаковые объемы растворов. В качестве альтернативы

возможно использование стерильных дисков из фильтровальной бумаги подходящего

качества; диски пропитывают растворами стандартного образца и растворами

испытуемого образца антибиотика и помещают на поверхность агара.

Для оценки пригодности методики количественного определения используют не менее

трех доз стандартного образца и трех соответствующих доз испытуемого образца

антибиотика, имеющих предположительно одинаковую активность. Желательно, чтобы

используемые дозы составляли геометрическую прогрессию. При рутинных испытаниях,

подходящей статистической схеме, кроме чашек Петри малого размера, на которых

невозможно разместить более шести растворов. Растворы испытуемого образца

антибиотика и стандартного образца чередуют таким образом, что бы исключить

взаимодействие более концентрированных растворов.

Чашки инкубируют при подходящей температуре около 18 ч. Для уменьшения влияния

разницы во времени между внесением растворов, используемых в испытании, и уточнения

линии регрессии, рекомендуется использовать предварительную диффузию при

комнатной температуре или, при необходимости, при температуре 4 °С в течение

определенного промежутка времени, обычно от 1 ч до 4 ч.

испытаний для одной дозы. Может быть проведено несколько определений, результаты

которых объединяют при статистической обработке для достижения требуемой точности

и подтверждения того, что активность испытуемого образца антибиотика не ниже

допустимой минимальной активности.

B. ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД

В подходящую питательную среду вносят суспензию выбранного микроорганизма,

обладающего чувствительностью к испытуемому образцу антибиотика, обеспечивающую

в условиях испытания достаточно сильное угнетение роста микроорганизмов. Используют

Используя растворитель и буферный раствор, указанные в таблице 2.7.2.−2, готовят

растворы стандартного образца и испытуемого образца антибиотика с известными

концентрациями предположительно одинаковой активностью.

Для подтверждения пригодности методики количественного определения используют не

менее трех доз стандартного образца и трех доз испытуемого образца антибиотика,

имеющих предположительно равную активность. Предпочтительно, чтобы используемые

дозы составляли геометрическую прогрессию. Для получения необходимой линейности

может потребоваться выбрать из большого количества три последовательные дозы,

используя соответствующие дозы для стандартного образца и испытуемого образца

антибиотика.

Равные объемы каждого из растворов вносят в одинаковые пробирки и прибавляют в

пробирки используют для настройки оптического прибора, используемого для измерения

роста.

Все пробирки располагают в случайном порядке по схеме латинского квадрата или

случайного блока и помещают на водяную баню или другое подходящее устройство,

позволяющее быстро довести температуру всех пробирок до требуемой температуры

инкубации, и выдерживают их при этой температуре от 3 ч до 4 ч, обеспечивая

однородность температуры и равное время инкубации.

По окончании периода инкубации останавливают рост микроорганизмов, добавляя в

Рассчитывают активность, используя соответствующие статистические методы.

Линейность преобразованной или непреобразованной зависимости отклика от дозы часто

получают лишь в ограниченном интервале. При расчетах активности следует

использовать только интервал, который включает, по крайней мере, три последовательные

дозы, что необходимо для проверки линейности. При рутинных испытаниях по

согласованию с уполномоченным органом определение можно проводить по двум

значениям при условии, что линейность подтверждена достаточным количеством

экспериментов с использованием трех значений. Однако во всех спорных случаях

необходимо применять вышеописанное определение по трем значениям.